Reconstructie van een Kv kanaal in Lipid Membranen voor structurele en functionele studies
Summary
Procedures voor volledige reconstructie van een prototype voltage-gated kalium kanaal in lipide membranen beschreven. De gereconstitueerde kanalen zijn geschikt voor biochemische assays, elektrische opnamen ligand screening en elektronenmicroscopie kristallografische studies. Deze methoden kunnen hebben algemene toepassingen om de structurele en functionele studies van andere membraaneiwitten.
Abstract
Om de lipide-eiwit interacties in een reductionistische manier bestuderen, is het noodzakelijk om de membraaneiwitten nemen in membranen van goed gedefinieerde lipidensamenstelling. We bestuderen de lipide-afhankelijke gating effecten in een prototype voltage-gated kalium (Kv) kanaal, en de gedetailleerde procedures voor het oplossen van de kanalen zijn uitgewerkt in verschillende membraan systemen. De reconstitutie die rekening houden beide detergent-geïnduceerde fusie van vesicles en het fusie-eiwit / detergens micellen van het lipide / detergens micellen en het van belang is om een evenwichtsverdeling van lipiden bij de eiwit / reinigende / lipiden en detergens / lipide micellen. Onze data suggereerde dat het inbrengen van de kanalen in het lipide vesicles relatief willekeurig oriëntaties en de reconstitutie efficiëntie zo hoog dat er geen detecteerbare eiwitcomplexen werden bij fractionering experimenten. We hebben het reconstrueren benutd kanalen conformationele toestanden van de kanalen te bepalen in verschillende lipiden, opnemen elektrische activiteiten van een klein aantal kanalen opgenomen in vlakke lipide dubbellagen scherm conformatie-specifieke liganden van een faagweergegeven peptidebibliotheek en de groei van kristallen 2D van de kanalen in membranen. De reconstitutie hier beschreven kan worden aangepast voor het bestuderen van andere membraaneiwitten in lipide bilagen, met name voor het onderzoek van de effecten op de lipiden eukaryote voltage-gated ionenkanalen.
Introduction
Cellen wisselen materiaal en informatie met hun omgeving door de functies van specifieke membraaneiwitten 1. Membraaneiwitten in celmembranen functioneren als pompen, kanalen, receptoren, intramembranair enzymen, linkers en structurele supporters over membranen. Mutaties die de membraaneiwitten invloed zijn gerelateerd aan vele menselijke ziekten. In feite, hebben veel membraaneiwitten de primaire drug targets, omdat ze belangrijk zijn en gemakkelijk toegankelijk zijn in celmembranen. Het is daarom erg belangrijk om de structuur en functie van diverse membraaneiwitten in membranen begrijpen, en maken het mogelijk om nieuwe methoden te ontwikkelen om de nadelige gevolgen van de mutante eiwitten in menselijke ziekten te verlichten.
Lipiden surround alle membraaneiwitten geïntegreerd in dubbellagen 2, 3. In eukaryote membranen, worden de verschillende typen lipiden bekende georganiseerd in microdomains 4, 5.Veel membraaneiwitten werden verspreid worden bij deze microdomains en de omvangrijke fase van membranen 3, 6 vloeistof. Het mechanisme dat de organisatie van de microdomeinen en de levering van membraaneiwitten in hen en de fysiologische betekenis van dergelijke uitkeringen zijn uiteraard belangrijk, maar nog slecht begrepen. Een grote technische moeilijkheden bij het bestuderen van de effecten op de lipiden membraaneiwitten is de betrouwbare reconstructie van biochemisch gezuiverde membraaneiwitten in membranen van goed gecontroleerde lipidesamenstelling zodat bijna alle gereconstitueerd eiwitten functioneel zijn 7. In de afgelopen jaren, hebben we het prototype voltage-gated kalium kanaal van A. ontwikkelde methoden te reconstrueren Pernix (KvAP) in verschillende membraan systemen voor structurele en functionele studies 8-10. De gegevens van anderen en ons samen gebleken dat de lipiden waarschijnlijk een determinant in conformationele veranderingen van de spanning-sensingdomeinen van een voltage-gated ionkanalen en kan de vorm van de structuur van sommige van deze kanalen 11. In het volgende zullen we een gedetailleerde beschrijving van onze methoden leveren en biedt kritische technische tips die waarschijnlijk zullen zorgen voor de succesvolle reproductie van onze resultaten, alsook de uitbreiding van onze methoden om de studies van andere membraaneiwitten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De reconstitutie van de KvAP kanalen in verschillende membranen is gebruikt in verscheidene studies 8-10. Na het idee voor de distributie van lipiden tussen detergens / lipide micellen en de eiwit / reinigende / lipide micellen, kunnen wij nagenoeg volledig oplossen van de KvAP bereiken in membranen gemaakt van zeer verschillende lipiden. Elke tetrameric KvAP kanaal moet ~ 100 vetmoleculen om volledig te dekken zijn transmembraan domein. De belangrijkste voorwaarde is om genoeg vetmoleculen te smelten in de e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De studies over KvAP in de Jiang lab hebben aanzienlijke hulp verkregen van het laboratorium van Dr Roderick MacKinnon's aan de Rockefeller University. Speciale dank gaat uit naar Dr Kathlynn Brown en Michael McQuire voor hun advies en hulp op onze faag-scherm experimenten. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH (GM088745 en GM093271 naar Q-XJ) en AHA (12IRG9400019 naar Q-XJ).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | RPI Corp. | T60060 | |
| Yeast Extract | RPI Corp. | Y20020 | |
| NaCl | Fisher | S271-3 | |
| Tris Base | RPI Corp. | T60040 | |
| Potassium Chloride | Fisher | BP366-500 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltoside | Affymetrix | D322S | Sol-grade |
| n-Octyl-β-D-Glucoside | Affymetrix | O311 | Ana-grade |
| Aprotinin | RPI Corp. | A20550-0.05 | |
| Leupeptin | RPI Corp. | L22035-0.025 | |
| Pepstatin A | RPI Corp. | P30100-0.025 | |
| PMSF | SIGMA | P7626 | |
| Dnase I | Roche | 13407000 | |
| Bio-Bead SM-2 | Bio-Rad | 152-3920 | |
| HEPES | RPI Corp. | H75030 | |
| POPE | Avanti Polar Lipids | 850757C | |
| POPG | Avanti Polar Lipids | 840457C | |
| DOGS | Avanti Polar Lipids | 870314C | |
| DMPC | Avanti Polar Lipids | 850345C | |
| Biotin-DOPE | Avanti Polar Lipids | 870282C | |
| DOTAP | Avanti Polar Lipids | 890890C | |
| NeutrAvidin agarose beads | Piercenet | 29200 | |
| Dialysis Tubing | Spectrum Laboratories, Inc | 132-570 | |
| Pentane | Fisher | R399-1 | |
| Decane | TCI America | D0011 | |
| MTS-PEG5000 | Toronto Research Cemicals | M266501 |
References
- Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2007).
- Lee, A. G. How lipids and proteins interact in a membrane: a molecular approach. Mol. Biosyst. 1, 203 (2005).
- Lee, A. G. How lipids affect the activities of integral membrane proteins. Biochim. Biophys. Acta. 1666, 62 (2004).
- Anderson, R. G. The caveolae membrane system. Annu. Rev. Biochem. 67, 199 (1998).
- Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 269 (2004).
- Edidin, M. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 257 (2003).
- Kapoor, R., Kim, J. H., Ingolfson, H., Andersen, O. S. Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments. J. Vis. Exp. (20), e1033 (2008).
- Zheng, H., Liu, W., Anderson, L. Y., Jiang, Q. X. Lipid-dependent gating of a voltage-gated potassium channel. Nat. Commun. 2, 250 (2011).
- Schmidt, D., Jiang, Q. X., MacKinnon, R. Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors. Nature. 444, 775 (2006).
- Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422, 180 (2003).
- Jiang, Q. X., Gonen, T. The influence of lipids on voltage-gated ion channels. Curr. Opin. Struct. Biol. , 3408884 (2012).
- Artimo, P., et al. ExPASy: SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40, W597 (2012).
- Cladera, J., Rigaud, J. L., Villaverde, J., Dunach, M. Liposome solubilization and membrane protein reconstitution using Chaps and Chapso. Eur. J. Biochem. 243, 798 (1997).
- Levy, D., Bluzat, A., Seigneuret, M., Rigaud, J. L. A systematic study of liposome and proteoliposome reconstitution involving Bio-Bead-mediated Triton X-100 removal. Biochim. Biophys. Acta. 1025, 179 (1990).
- Young, H. S., Rigaud, J. L., Lacapere, J. J., Reddy, L. G., Stokes, D. L. How to make tubular crystals by reconstitution of detergent-solubilized Ca2(+)-ATPase. Biophys. J. 72, 2545 (1997).
- Levy, D., Gulik, A., Bluzat, A., Rigaud, J. L. Reconstitution of the sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase: mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. Biochim. Biophys. Acta. 1107, 283 (1992).
- Cohen, F. S., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. Fusion of phospholipid vesicles with planar phospholipid bilayer membranes. II. Incorporation of a vesicular membrane marker into the planar membrane. The Journal of General Physiology. 75, 251 (1980).
- Fuks, B., Homble, F. Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids. Biophysical Journal. 66, 1404 (1994).
- Hanke, W., Schlue, W. -. R., Sattelle, D. B. Planar Lipid Bilayers. Methods and Applications. Biological Techniques. , 133 (1993).
- Tien, H. T. . Bilayer lipid membranes (BLM). Theory and Practice. , 655-65 (1974).
- Pagano, R. E., Ruysschaert, J. M., Miller, I. R. The molecular composition of some lipid bilayer membranes in aqueous solution. The Journal of Membrane Biology. 10, 11 (1972).
- Henn, F. A., Thompson, T. E. Properties of lipid bilayer membranes separating two aqueous phases: composition studies. Journal of Molecular Biology. 31, 227 (1968).
- Tao, X., MacKinnon, R. Functional analysis of Kv1.2 and paddle chimera Kv channels in planar lipid bilayers. J. Mol. Biol. 382, 24 (2008).
- Cohen, F. S., Akabas, M. H., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. Parameters affecting the fusion of unilamellar phospholipid vesicles with planar bilayer membranes. The Journal of Cell Biology. 98, 1054 (1984).
- Smith, G. P., Petrenko, V. A. Phage Display. Chem. Rev. 97, 391-39 (1997).
- McGuire, M. J., Li, S., Brown, K. C. Biopanning of phage displayed peptide libraries for the isolation of cell-specific ligands. Methods Mol. Biol. 504, 291 (2009).
- Rigaud, J. L. Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals. Braz. J. Med. Biol. Res. 35, 753 (2002).
- Chami, M., et al. Use of octyl beta-thioglucopyranoside in two-dimensional crystallization of membrane proteins. J. Struct. Biol. 133, 64 (2001).
- Kuhlbrandt, W. Two-dimensional crystallization of membrane proteins. Q. Rev. Biophys. 25, 1 (1992).
- Rigaud, J. L., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65 (2003).
- Walz, T., Grigorieff, N. Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins. J. Struct. Biol. 121 (2), 142 (1998).
- Signorell, G. A., Kaufmann, T. C., Kukulski, W., Engel, A., Remigy, H. W. Controlled 2D crystallization of membrane proteins using methyl-beta-cyclodextrin. J. Struct. Biol. 157, 321 (2007).
- Vink, M., Derr, K., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins. J. Struct. Biol. 160, 295 (2007).
- Iacovache, I., et al. The 2DX robot: a membrane protein 2D crystallization Swiss Army knife. J. Struct. Biol. 169, 370 (2010).
