Rekonstitution eines Kv-Kanal in Lipidmembranen für Strukturelle und Funktionelle Studien
Summary
Verfahren zur vollständigen Auflösung des Prototyps spannungsabhängigen Kaliumkanal in Lipid-Membranen beschrieben. Die rekonstituierten Kanäle sind für biochemische Assays, elektrische Aufnahmen, Liganden-Screening und Elektronen kristallographische Untersuchungen geeignet. Diese Methoden können allgemeine Anwendungen auf die strukturelle und funktionelle Studien anderer Membranproteine.
Abstract
Um die Lipid-Protein-Interaktion in einer reductionistic Weise zu untersuchen, ist es notwendig, die Membranproteine in Membranen von definierten Lipid-Zusammensetzung einzuarbeiten. Wir untersuchen die Lipid-Gating-Effekte in einem Prototyp spannungsabhängigen Kalium-(KV)-Kanal und haben detaillierte Verfahren zur Wiederherstellung der Kanäle in verschiedene Membran-Systemen gearbeitet. Unsere Rekonstitution Verfahren nehmen Berücksichtigung sowohl Waschmittel-induzierte Fusion von Vesikeln und die Fusion von Protein / Detergensmicellen mit der Lipid / Detergens gemischte Mizellen und der es wichtig ist, ein Gleichgewicht Verteilung von Lipiden bei der Protein / Detergens / Lipid-und Reinigungsmittel / Lipid-Mischmicellen. Unsere Daten deuten darauf hin, dass das Einfügen der Kanäle in der Lipidvesikel relativ zufällig in Ausrichtungen, und die Rekonstitution Wirkungsgrad ist so hoch, dass keine nachweisbaren Proteinaggregate in Fraktionierungsexperimente beobachtet. Wir haben die Rekonstitution verwendetd Kanäle, um die Konformationen der Kanäle in verschiedenen Lipiden zu bestimmen, notieren elektrischen Aktivitäten von einer kleinen Anzahl von Kanälen in planaren Lipiddoppelschichten eingebaut, Bildschirm für Exterieur-spezifischen Liganden aus einer Phagen-Peptid-Bibliothek angezeigt, und unterstützt das Wachstum von 2D-Kristallen der Kanäle in den Membranen. Die Rekonstitution hier beschriebenen Verfahren kann zur Untersuchung anderer Membranproteine in Lipid-Doppelschichten, insbesondere für die Untersuchung der Lipid-Wirkungen auf den eukaryotischen spannungsgesteuerten Ionenkanälen angepasst werden.
Introduction
Cells Austausch Materialien und Informationen mit ihrer Umgebung durch die Funktionen bestimmter Membranproteine 1. Membranproteine in Zellmembranen funktionieren wie Pumpen, Kanäle, Rezeptoren, Enzyme intramembrane, Linker und strukturelle Unterstützer über Membranen. Mutationen, die die Membranproteine beeinflussen wurden im Zusammenhang mit vielen Krankheiten des Menschen. In der Tat haben viele Membranproteine die primären Angriffspunkte für Arzneimittel, da sie wichtige und leicht zugänglich in Zellmembranen sind. Es ist daher sehr wichtig, die Struktur und Funktion der Membranproteine in Membranen zu verstehen, und es ermöglichen, neue Verfahren zu entwickeln, um die schädlichen Wirkungen von den mutierten Proteinen in menschlichen Krankheiten zu lindern.
Lipide umgeben alle Membranproteine in Doppelschichten 2, 3 integriert. In eukaryotischen Membranen werden die verschiedenen Arten von Lipiden bekannt, in Mikrodomänen 4, 5 durchgeführt werden.Viele Membranproteine gezeigt, unter diesen Mikrodomänen sowie die sperrigen fluiden Phase Membranen 3, 6 verteilt werden. Der Mechanismus der Organisation der Mikrodomänen und die Lieferung von Membranproteinen in ihnen und der physiologischen Bedeutung dieser Distributionen sind zweifellos wichtig, sondern bleiben weitgehend unverstanden. Eine wichtige technische Schwierigkeit bei der Untersuchung der Auswirkungen auf die Lipid-Membran-Proteine ist die zuverlässige Wiederherstellung der biochemisch gereinigten Membranproteinen in Membranen von gut kontrollierten Lipid-Zusammensetzung, so dass fast alle Proteine funktionell rekonstituiert 7 sind. In den letzten Jahren haben wir Verfahren zur Wiederherstellung der Prototyp spannungsabhängigen Kaliumkanal von A. pernix (KvAP) in verschiedenen Membran-Systeme für die strukturelle und funktionelle Studien 8-10. Die Daten von anderen und uns zusammen zeigte, dass die Lipide sind wahrscheinlich ausschlaggebend für die Konformationsänderungen des SpannungsmessgerätDomänen eines spannungsabhängigen Ionenkanal kann formen die Strukturen einiger dieser Kanäle 11. In der nächsten, werden wir eine detaillierte Beschreibung unserer Methoden und kritischen technischen Tipps, die wahrscheinlich zu gewährleisten wird die erfolgreiche Reproduktion unserer Ergebnisse sowie die Erweiterung unserer Methoden zum Studium von anderen Membranproteinen bieten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Wiederherstellung der KvAP Kanäle in unterschiedlichen Membranen wurde in mehreren Studien 8-10 verwendet worden. Nach der Idee der Sicherstellung der Verteilung der Lipide zwischen Reinigungsmittel / Lipid Mischmizellen und die Protein / Reinigungsmittel / Lipid Mischmizellen, sind wir in der Lage, nahezu vollständige Wiederherstellung der KvAP in Membranen von sehr unterschiedlichen Lipiden zu erreichen. Jeder tetrameren KvAP Kanal benötigt ~ 100 Lipidmolekülen zur Deckung seiner Transmembrandomäne…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Studien über KvAP im Jiang Labor haben erhebliche Hilfe von Dr. Roderick MacKinnon Labor erhalten an der Rockefeller University. Besonderer Dank geht an Dr. Kathlynn Brown und Michael McQuire gehen für ihre Beratung und Hilfe auf unserem Phagen-Display Experimente. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus NIH (GM088745 und GM093271 zu Q-XJ) und AHA (12IRG9400019 zu Q-XJ) unterstützt.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | RPI Corp. | T60060 | |
| Yeast Extract | RPI Corp. | Y20020 | |
| NaCl | Fisher | S271-3 | |
| Tris Base | RPI Corp. | T60040 | |
| Potassium Chloride | Fisher | BP366-500 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltoside | Affymetrix | D322S | Sol-grade |
| n-Octyl-β-D-Glucoside | Affymetrix | O311 | Ana-grade |
| Aprotinin | RPI Corp. | A20550-0.05 | |
| Leupeptin | RPI Corp. | L22035-0.025 | |
| Pepstatin A | RPI Corp. | P30100-0.025 | |
| PMSF | SIGMA | P7626 | |
| Dnase I | Roche | 13407000 | |
| Bio-Bead SM-2 | Bio-Rad | 152-3920 | |
| HEPES | RPI Corp. | H75030 | |
| POPE | Avanti Polar Lipids | 850757C | |
| POPG | Avanti Polar Lipids | 840457C | |
| DOGS | Avanti Polar Lipids | 870314C | |
| DMPC | Avanti Polar Lipids | 850345C | |
| Biotin-DOPE | Avanti Polar Lipids | 870282C | |
| DOTAP | Avanti Polar Lipids | 890890C | |
| NeutrAvidin agarose beads | Piercenet | 29200 | |
| Dialysis Tubing | Spectrum Laboratories, Inc | 132-570 | |
| Pentane | Fisher | R399-1 | |
| Decane | TCI America | D0011 | |
| MTS-PEG5000 | Toronto Research Cemicals | M266501 |
References
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