구조 및 기능 연구를위한 지질 막에 Kv 값 채널의 재구성
Summary
지질 세포막에 프로토 타입 전압 문이 칼륨 채널의 완전한 재구성에 대한 절차를 설명합니다. 재구성 채널은 생화학 적 분석, 전기 녹음, 리간드 스크리닝 및 전자 결정학 연구에 적합합니다. 이러한 방법은 다른 막 단백질의 구조 및 기능 연구에 일반적으로 응용 프로그램이있을 수 있습니다.
Abstract
축소 된 패션 지질 단백질 상호 작용을 연구하기 위해, 잘 정의 된 지질 성분의 막으로 막 단백질을 통합 할 필요가있다. 우리는 프로토 타입 전압 문 칼륨 (Kv 값) 채널의 지질에 따라 게이트 효과를 공부하고, 다른 멤브레인 시스템으로 재구성 채널에 대한 자세한 절차를 일한. 우리 재구성 절차는 세제에 의한 소포의 융합 단백질 / 세제 지질 / 세제 혼합 미셀과 미셀뿐만 아니라 단백질 / 세제 / 지질과 세제 간의 지질의 평형 분포에 도달의 중요성의 융합을 모두 고려 걸릴 / 지질 혼합 미셀. 우리의 데이터는 지질 소포에있는 채널의 삽입 방향이 상대적으로 무작위 것을 제안하고, 재구성 효율은 감지 단백질 집계가 분획 실험에서 나타나지 않았다 너무 높다. 우리는 재구성을 활용 한다른 지질 채널의 구조적 상태를 결정하는 D 채널은 평면 지질 이중층에 통합 채널의 소수 파지 – 표시 펩타이드 라이브러리의 형태 특정 리간드에 대한 화면의 전기적 활동을 기록하고, 2 차원 결정의 성장을 지원 세포막 채널. 여기에 설명 된 재구성 절차는 특히 진핵 전압 게이트 이온 채널의 지질 효과를 조사, 지질 이중층의 다른 막 단백질 연구에 맞게 수 있습니다.
Introduction
전지 교환 재료 및 특정 막 단백질 1의 기능을 통해 환경 정보를 제공합니다. 세포막에있는 막 단백질 펌프, 채널, 수용체, intramembrane 효소, 링커 및 세포막에 걸쳐 구조 후원자로 작동합니다. 막 단백질에 영향을 미치는 돌연변이는 많은 인간의 질병에 관련되어있다. 그들은 중요하고 세포막에 쉽게 접근 할 수 있기 때문에 사실, 많은 막 단백질은 기본 약물 표적이었다. 그것은 세포막의 다양한 막 단백질의 구조와 기능을 이해하고, 그것이 가능한 인간의 질병에 돌연변이 단백질의 해로운 영향을 완화하기 위해 새로운 방법을 고안 할 수 있도록하는 것이 매우 중요합니다.
지질 이중층 2, 3에 통합 된 모든 막 단백질을 둘러싸고 있습니다. 진핵 세포의 세포막, 지질의 여러 가지 유형 microdomains 4, 5로 구성되는 것으로 알려져있다.많은 막 단백질이 microdomains뿐만 아니라 세포막 3, 6의 부피가 큰 유체 상에 분산 할 보였다. microdomains 및 막 단백질의 전달 그들에와 같은 배포판의 생리적 의미의 조직을 기본 메커니즘은 분명 중요하지만 제대로 이해 남아있다. 막 단백질의 지질 효과를 연구 한 주요 기술적 인 어려움은 거의 모든 재구성 단백질 기능 7아르 수 있도록 생화학 적으로 잘 통제 지질 성분의 막으로 막 단백질을 정제 안정적인 재구성이다. 지난 몇 년 동안, 우리는 다시 구성 A.에서 프로토 타입 전압 문이 칼륨 채널을 방법을 개발 구조 및 기능 연구 8-10에 대한 다양한 멤브레인 시스템에 pernix (KvAP). 다른 사람의 데이터와 우리가 함께 지질 가능성이 전압 감지의 구조적 변화 결정 요인임을 보여 주었다전압 – 게이트 이온 채널의 도메인이 채널 11의 일부 구조를 형성 할 수 있습니다. 다음에, 우리는 우리의 방법에 대한 자세한 설명을 제공하고 가능성이 우리의 결과를 성공적으로 재현뿐만 아니라 다른 막 단백질의 연구에 대한 우리의 방법의 확장을 보장합니다 중요한 기술 팁을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
다른 막에 KvAP 채널의 재구성은 여러 연구 8-10에서 사용되었다. 세제 / 지질 혼합 미셀과 단백질 / 세제 / 지질 혼합 미셀 간 지질의 분포를 보장의 아이디어에 따라, 우리는 매우 다른 지질 만들어진 세포막에 KvAP의 거의 완전한 재구성에 도달 할 수 있습니다. 각각의 합체 KvAP 채널은 완벽하게 그 횡단 영역을 커버 ~ 100 지질 분자가 필요합니다. 필수 요구 사항은 세제가 제거되기 전에 충분…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
장 실험실에서 KvAP에 대한 연구는 록펠러 대학에서 박사 로데릭 맥키의 연구실에서 상당한 도움을 얻을 수있다. 특별 감사는 조언 박사 Kathlynn 브라운과 마이클 McQuire에 가서 우리의 파지 화면 실험에 도움이됩니다. 이 작품은 NIH (Q-XJ에 GM088745와 GM093271) 및 AHA (Q-XJ에 12IRG9400019)에서 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | RPI Corp. | T60060 | |
| Yeast Extract | RPI Corp. | Y20020 | |
| NaCl | Fisher | S271-3 | |
| Tris Base | RPI Corp. | T60040 | |
| Potassium Chloride | Fisher | BP366-500 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltoside | Affymetrix | D322S | Sol-grade |
| n-Octyl-β-D-Glucoside | Affymetrix | O311 | Ana-grade |
| Aprotinin | RPI Corp. | A20550-0.05 | |
| Leupeptin | RPI Corp. | L22035-0.025 | |
| Pepstatin A | RPI Corp. | P30100-0.025 | |
| PMSF | SIGMA | P7626 | |
| Dnase I | Roche | 13407000 | |
| Bio-Bead SM-2 | Bio-Rad | 152-3920 | |
| HEPES | RPI Corp. | H75030 | |
| POPE | Avanti Polar Lipids | 850757C | |
| POPG | Avanti Polar Lipids | 840457C | |
| DOGS | Avanti Polar Lipids | 870314C | |
| DMPC | Avanti Polar Lipids | 850345C | |
| Biotin-DOPE | Avanti Polar Lipids | 870282C | |
| DOTAP | Avanti Polar Lipids | 890890C | |
| NeutrAvidin agarose beads | Piercenet | 29200 | |
| Dialysis Tubing | Spectrum Laboratories, Inc | 132-570 | |
| Pentane | Fisher | R399-1 | |
| Decane | TCI America | D0011 | |
| MTS-PEG5000 | Toronto Research Cemicals | M266501 |
References
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