Tilberedning av en Kv Channel i lipid membraner for strukturelle og funksjonelle studier
Summary
Prosedyrer for fullstendig rekonstituering av en prototyp spenningsstyrte kaliumkanaler inn i lipidmembraner, er beskrevet. De rekonstituerte kanaler er egnet for biokjemiske analyser, elektriske innspillinger, ligand screening og elektron krystallografisk studier. Disse metodene kan ha generell anvendelse til de strukturelle og funksjonelle studier av andre membranproteiner.
Abstract
For å studere lipid og protein i en reductionistic måte, er det nødvendig å innlemme membran proteiner inn i membraner av veldefinerte lipidsammensetning. Vi studerer lipid-avhengige gating effekter i en prototype spenning-gated potassium (Kv) kanal, og har jobbet ut detaljerte prosedyrer for å gjeninnføre kanalene i ulike membransystemer. Våre reconstitution prosedyrer tar hensyn til både vaskemiddel-indusert fusjon av blemmer og sammensmeltingen av protein / vaskemiddel micelles med lipid / vaskemiddel blandet micelles samt betydningen av å nå en likevekt fordeling av lipider mellom protein / vaskemiddel / lipid og vaskemiddel / lipid blandet micelles. Våre data antyder at innsetting av kanalene i de lipidvesikler er forholdsvis slumpmessig i orienteringer, og rekonstituering virkningsgrad er så høy at ingen påviselige protein aggregater ble observert i eksperimenter fraksjonering. Vi har benyttet rekonstituererd kanaler for å bestemme de konformasjonsforandringer statene kanalene i ulike lipider, registrere elektriske aktiviteter av et lite antall kanaler som inngår i planar lipid bilayers, skjerm for eksteriør-spesifikke ligander fra en fag-displayed peptid bibliotek og støtte veksten av 2D krystaller av kanalene i membranene. Tilberedning beskrevet her kan tilpasses for å studere andre membran proteiner i lipid bilayers, spesielt for undersøkelse av lipid effekter på eukaryote spenningsstyrte ionekanaler.
Introduction
Celler utveksle materiale og informasjon med sine omgivelser gjennom funksjonene til spesifikke membran proteiner en. Membran proteiner i cellemembraner fungere som pumper, kanaler, reseptorer, intramembrane enzymer, linkers og strukturelle støttespillere over membraner. Mutasjoner som påvirker membran proteiner har vært knyttet til mange menneskelige sykdommer. Faktisk har mange membranproteiner vært de primære stoff mål fordi de er viktige og lett tilgjengelig i cellemembraner. Det er derfor svært viktig å forstå strukturen og funksjonen til ulike membran proteiner i membraner, og gjøre det mulig å utvikle nye metoder for å lindre skadevirkningene fra den muterte proteiner i menneskelige sykdommer.
Lipider surround alle membran proteiner integrert i to bilayers, tre. I eukaryote membraner, vises de forskjellige ulike typer av lipider kjent for å være organisert i mikroområder 4, 5.Mange membranproteiner ble vist å bli distribuert blant disse mikroområder samt voluminøse fluidfase av membranene 3, 6. Mekanismen bak organiseringen av mikroområder og levering av membran proteiner inn i dem og den fysiologiske betydningen av slike utdelinger er helt klart viktig, men er fortsatt dårlig forstått. En stor tekniske problemer i å studere lipid effekter på membran proteiner er pålitelig rekonstituering av biokjemisk renset membran proteiner i membraner av godt kontrollert lipid sammensetning, slik at nesten alle rekonstituert proteiner er funksjonelle 7. I de siste årene, har vi utviklet metoder for å rekonstruere prototypen spenning gated kalium kanal fra A. pernix (KvAP) i ulike membransystemer for strukturelle og funksjonelle studier 8-10. Dataene fra andre og oss sammen viste at lipidene er sannsynligvis en determinant i konformasjonsendringer i spennings-sensingdomener av et spenningsstyrte ionekanal og kan forme strukturer av noen av disse kanalene 11. I den neste, vil vi gi en detaljert beskrivelse av våre metoder og vil tilby kritiske tekniske tips som trolig vil sikre en vellykket reproduksjon av våre resultater, samt utvidelse av våre metoder til studier av andre membran proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tilberedning av KvAP kanaler i forskjellige membraner har vært brukt i flere studier 8-10. Etter ideen med å sikre fordelingen av lipider mellom vaskemiddel / lipid blandede miceller og proteinet / vaskemiddel / lipid blandet miceller, er vi i stand til å nå nesten fullstendig rekonstituering av KvAP inn membraner laget av meget forskjellige lipider. Hver tetramerisk KvAP kanalene må ~ 100 lipidmolekyler å fullt ut dekke sin transmembrane domene. Det grunnleggende kravet er å tillate nok lipidmolekyler…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studiene på KvAP i Jiang lab har fått betydelig hjelp fra dr. Roderick MacKinnon laboratorium ved Rockefeller University. Spesiell takk går til Dr. Kathlynn Brown og Michael McQuire for sine råd og hjelp på våre fag-skjermen eksperimenter. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra NIH (GM088745 og GM093271 til Q-XJ) og AHA (12IRG9400019 til Q-XJ).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | RPI Corp. | T60060 | |
| Yeast Extract | RPI Corp. | Y20020 | |
| NaCl | Fisher | S271-3 | |
| Tris Base | RPI Corp. | T60040 | |
| Potassium Chloride | Fisher | BP366-500 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltoside | Affymetrix | D322S | Sol-grade |
| n-Octyl-β-D-Glucoside | Affymetrix | O311 | Ana-grade |
| Aprotinin | RPI Corp. | A20550-0.05 | |
| Leupeptin | RPI Corp. | L22035-0.025 | |
| Pepstatin A | RPI Corp. | P30100-0.025 | |
| PMSF | SIGMA | P7626 | |
| Dnase I | Roche | 13407000 | |
| Bio-Bead SM-2 | Bio-Rad | 152-3920 | |
| HEPES | RPI Corp. | H75030 | |
| POPE | Avanti Polar Lipids | 850757C | |
| POPG | Avanti Polar Lipids | 840457C | |
| DOGS | Avanti Polar Lipids | 870314C | |
| DMPC | Avanti Polar Lipids | 850345C | |
| Biotin-DOPE | Avanti Polar Lipids | 870282C | |
| DOTAP | Avanti Polar Lipids | 890890C | |
| NeutrAvidin agarose beads | Piercenet | 29200 | |
| Dialysis Tubing | Spectrum Laboratories, Inc | 132-570 | |
| Pentane | Fisher | R399-1 | |
| Decane | TCI America | D0011 | |
| MTS-PEG5000 | Toronto Research Cemicals | M266501 |
References
- Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2007).
- Lee, A. G. How lipids and proteins interact in a membrane: a molecular approach. Mol. Biosyst. 1, 203 (2005).
- Lee, A. G. How lipids affect the activities of integral membrane proteins. Biochim. Biophys. Acta. 1666, 62 (2004).
- Anderson, R. G. The caveolae membrane system. Annu. Rev. Biochem. 67, 199 (1998).
- Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 269 (2004).
- Edidin, M. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 257 (2003).
- Kapoor, R., Kim, J. H., Ingolfson, H., Andersen, O. S. Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments. J. Vis. Exp. (20), e1033 (2008).
- Zheng, H., Liu, W., Anderson, L. Y., Jiang, Q. X. Lipid-dependent gating of a voltage-gated potassium channel. Nat. Commun. 2, 250 (2011).
- Schmidt, D., Jiang, Q. X., MacKinnon, R. Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors. Nature. 444, 775 (2006).
- Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422, 180 (2003).
- Jiang, Q. X., Gonen, T. The influence of lipids on voltage-gated ion channels. Curr. Opin. Struct. Biol. , 3408884 (2012).
- Artimo, P., et al. ExPASy: SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40, W597 (2012).
- Cladera, J., Rigaud, J. L., Villaverde, J., Dunach, M. Liposome solubilization and membrane protein reconstitution using Chaps and Chapso. Eur. J. Biochem. 243, 798 (1997).
- Levy, D., Bluzat, A., Seigneuret, M., Rigaud, J. L. A systematic study of liposome and proteoliposome reconstitution involving Bio-Bead-mediated Triton X-100 removal. Biochim. Biophys. Acta. 1025, 179 (1990).
- Young, H. S., Rigaud, J. L., Lacapere, J. J., Reddy, L. G., Stokes, D. L. How to make tubular crystals by reconstitution of detergent-solubilized Ca2(+)-ATPase. Biophys. J. 72, 2545 (1997).
- Levy, D., Gulik, A., Bluzat, A., Rigaud, J. L. Reconstitution of the sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase: mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. Biochim. Biophys. Acta. 1107, 283 (1992).
- Cohen, F. S., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. Fusion of phospholipid vesicles with planar phospholipid bilayer membranes. II. Incorporation of a vesicular membrane marker into the planar membrane. The Journal of General Physiology. 75, 251 (1980).
- Fuks, B., Homble, F. Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids. Biophysical Journal. 66, 1404 (1994).
- Hanke, W., Schlue, W. -. R., Sattelle, D. B. Planar Lipid Bilayers. Methods and Applications. Biological Techniques. , 133 (1993).
- Tien, H. T. . Bilayer lipid membranes (BLM). Theory and Practice. , 655-65 (1974).
- Pagano, R. E., Ruysschaert, J. M., Miller, I. R. The molecular composition of some lipid bilayer membranes in aqueous solution. The Journal of Membrane Biology. 10, 11 (1972).
- Henn, F. A., Thompson, T. E. Properties of lipid bilayer membranes separating two aqueous phases: composition studies. Journal of Molecular Biology. 31, 227 (1968).
- Tao, X., MacKinnon, R. Functional analysis of Kv1.2 and paddle chimera Kv channels in planar lipid bilayers. J. Mol. Biol. 382, 24 (2008).
- Cohen, F. S., Akabas, M. H., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. Parameters affecting the fusion of unilamellar phospholipid vesicles with planar bilayer membranes. The Journal of Cell Biology. 98, 1054 (1984).
- Smith, G. P., Petrenko, V. A. Phage Display. Chem. Rev. 97, 391-39 (1997).
- McGuire, M. J., Li, S., Brown, K. C. Biopanning of phage displayed peptide libraries for the isolation of cell-specific ligands. Methods Mol. Biol. 504, 291 (2009).
- Rigaud, J. L. Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals. Braz. J. Med. Biol. Res. 35, 753 (2002).
- Chami, M., et al. Use of octyl beta-thioglucopyranoside in two-dimensional crystallization of membrane proteins. J. Struct. Biol. 133, 64 (2001).
- Kuhlbrandt, W. Two-dimensional crystallization of membrane proteins. Q. Rev. Biophys. 25, 1 (1992).
- Rigaud, J. L., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65 (2003).
- Walz, T., Grigorieff, N. Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins. J. Struct. Biol. 121 (2), 142 (1998).
- Signorell, G. A., Kaufmann, T. C., Kukulski, W., Engel, A., Remigy, H. W. Controlled 2D crystallization of membrane proteins using methyl-beta-cyclodextrin. J. Struct. Biol. 157, 321 (2007).
- Vink, M., Derr, K., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins. J. Struct. Biol. 160, 295 (2007).
- Iacovache, I., et al. The 2DX robot: a membrane protein 2D crystallization Swiss Army knife. J. Struct. Biol. 169, 370 (2010).
