La barre stabilisatrice: Administration de l'alcool à mouches
Summary
Drosophila a émergé comme un système modèle important pour disséquer les fondements cellulaires et moléculaires de réponses comportementales à l'alcool. Nous présentons ici un protocole pour la collecte de données sur la sensibilité de l'alcool dans un contexte circadien qui peut être facilement appliquée à d'autres expériences et est bien adapté pour la recherche de premier cycle.
Abstract
Les mouches des fruits (Drosophila melanogaster) sont un modèle établi pour la recherche de l'alcool et de la biologie circadienne. Récemment, nous avons montré que l'horloge circadienne module la sensibilité à l'alcool, mais pas la formation de la tolérance. Ici, nous décrivons notre protocole en détail. L'alcool est administré à vol utilisant la barre stabilisatrice. Dans cette configuration, la vapeur d'alcool saturé est mélangé avec l'air humidifié dans des proportions fixes, et administré à vol dans quatre tubes simultanément. Les mouches sont élevées dans des conditions normalisées de manière à minimiser la variation entre les répétitions. Trois jours anciens mouches de différents génotypes ou de traitements sont utilisés pour les expériences, de préférence par vol de deux points différents dans le temps (par exemple, CT 5 et CT 17) de faire des comparaisons directes possible correspondant. Pendant l'expérience, les mouches sont exposés pendant 1 heure pour le pourcentage prédéterminé de la vapeur d'alcool et le nombre de mouches qui présentent la perte du réflexe de redressement (Lorr) ou sedation sont comptées toutes les 5 min. Les données peuvent être analysées selon trois approches statistiques différentes. La première consiste à déterminer l'heure à laquelle 50% des mouches ont perdu leur réflexe de redressement et en utilisant une analyse de la variance (ANOVA) pour déterminer s'il existe des différences significatives entre les points dans le temps. Le second est de déterminer le pourcentage des mouches qui montrent Lorr après un certain nombre de minutes, suivie d'une analyse de variance. La dernière méthode est d'analyser l'ensemble des séries chronologiques en utilisant les statistiques multivariées. Le protocole peut également être utilisé pour des expériences ou des comparaisons non circadiens entre les génotypes.
Introduction
Drosophila melanogaster démontrer réponses comportementales biphasique à l'alcool 1 qui sont analogues aux réponses humaines à ce médicament 2,3. Lors de l'exposition initiale à de faibles concentrations d'alcool, les mouches augmentation de l'activité locomotrice d'exposition, remplacé par un manque de coordination motrice, la perte du contrôle postural et les réflexes de redressement (perte du réflexe de redressement: Lorr), et une sédation (absence complète de l'activité du moteur en réponse à la stimulation mécanique) que l'exposition à l'alcool progresse 4-9. L'horloge circadienne endogène est une forte modulateur de la sensibilité de l'alcool et de la toxicité comme observé chez les souris, les rats 10,11 12, et les humains 13. Les avancées récentes dans la recherche drosophile ont montré l'horloge circadienne module sensibilité aiguë à l'alcool mais pas tolérance à l'alcool 1. Les approches génétiques puissants disponibles chez la drosophile par des études de mutants et les manipulations transgéniques de l'espaceet l'expression des gènes temporelle fournir un système qui permet de rapides progrès dans l'identification des mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents aux comportements complexes. L'utilisation de la drosophile comme un outil d'enquête a permis des avancées importantes dans la compréhension de la neurobiologie de l'alcool qui peuvent être traduits rapidement aux mammifères 14-16. Afin de faciliter la compréhension des mécanismes moléculaires par lesquels l'horloge circadienne module la sensibilité à l'alcool et à mesurer de manière uniforme à travers les réponses comportementales points de temps circadiens, un protocole d'administration de l'alcool approprié pour une utilisation dans des conditions de faible lumière rouge est nécessaire. Pour la drosophile, l'alcool peut être administré par une supplémentation alimentaire pour une exposition chronique ou de manière fiable grâce à l'administration d'alcool sous forme de vapeur pour des expositions aiguës. Ici, nous décrivons un protocole d'administration d'alcool approprié pour l'évaluation de la modulation circadienne de la perte-de-réflexe (Lorr) 1 ainsi quesédation.
Les mouches sont entraînés avec 12 h: 12 h cycles LD à température constante, puis transférés à un régime de lumière contrôlée pendant 2-5 jours en fonction de la question expérimentale. Les mouches sont exposés à la vapeur d'éthanol dans un dispositif connu sous le nom la barre stabilisatrice. Dans ce dispositif, des quantités contrôlées d'air sont à barboter dans l'eau et l'alcool; les vapeurs sont ensuite mélangés et dirigés dans un boîtier flacon les mouches. Toutes les 5 min vol sont marqués pour le nombre que ne parvient pas à afficher redressement réflexes ou sont devenus des sédatifs. Pourcentages Lorr pour chaque point de temps sont calculés et comparés entre les points de temps circadiens ou entre les souches de mouches. La simplicité et la fiabilité de la livraison d'alcool en utilisant la livraison d'alcool barre stabilisatrice combinée avec des options d'analyse comportementale fournit un avantage significatif pour les expériences menées circadiens dans des conditions sombres.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les coûts de l'abus d'alcool et l'alcoolisme pour la société est énorme, tant en termes de coûts humains et économiques 29 30,31. Drosophile comme modèle propose un système rapide et souple pour examiner rapidement les réponses comportementales d'un grand nombre d'individus et en tant que tel a été largement utilisé à la fois pour la recherche et l'alcool 5,7,32-34 circadien 35-37.
Ici, nous avons décrit un proto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le financement de cette recherche a été assuré par un programme en neurosciences Prix de la Florida State University College of Medicine et le soutien du Département de sciences biologiques à l'ex-URSS. Le financement supplémentaire a été fourni par une subvention en aide provenant du Fonds de recherche de la vente d'alcool Fabricant.
Materials
| Alcohol 190 proof | Various | ||
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Aerator | Local pet store | We use Whisper 60 | |
| Silicone tubing 1/8” | VWR | 408060-0030 | |
| 120° Y Connector | VWR | 82017-256 | |
| Quick disconnects | VWR | 46600-048 | |
| Plastic tube clamps | Bell-art products | 132250000 | Either this or next |
| Miniature Air Regulator | McMaster-Carr | 8727K11 | Either this or previous |
| Miniature Air Regulator Mounting Bracket | McMaster-Carr | 9891K66 | |
| Gilmont size 12 flow meter | VWR | 29895-242 | |
| Tool clips | McMaster-Carr | 1722A43 | To hold flow meters |
| Vial | VWR | 89092-722 | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59585-186 | Fits in vials |
| 5 mm Pyrex Glass tubes | Trikinetics | PGT5x65 | Fits best in previous stopper. |
| Teflon tape | Hardware store | To achieve snug fit in stoppers if necessary | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59582-122 | Fits our bottles |
| Disposable glass pipets | VWR | 53283-768 | Cut to length and bend by heating |
| Very fine nylon netting | VWR | Various | |
| 15 watt bulbs | Hardware store | Overhead red light | |
| Photographic red safe light filters | Overhead red light | ||
| Mini Flashlights with red filters | Mag-light |
References
- Linde, K., Lyons, L. C. Circadian modulation of acute alcohol sensitivity but not acute tolerance in Drosophila. Chronobiol. Int. 28, 397-406 (2011).
- Kaun, K. R., Azanchi, R., Maung, Z., Hirsh, J., Heberlein, U. A Drosophila model for alcohol reward. Nat Neurosci. 14, 612-619 (2011).
- Shohat-Ophir, G., Kaun, K. R., Azanchi, R., Mohammed, H., Heberlein, U. Sexual deprivation increases ethanol intake in Drosophila. Science. 335, 1351-1355 (2012).
- Bellen, H. J. The fruit fly: A model organism to study the genetics of alcohol abuse and addiction. Cell. 93, 909-912 (1998).
- Guarnieri, D. J., Heberlein, U. Drosophila melanogaster, a genetic model system for alcohol research. International Review of Neurobiology. 54, 203-232 (2003).
- Scholz, H. Intoxicated fly brains: Neurons mediating ethanol-induced behaviors. J. Neurogenet. 23, 111-119 (2009).
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. Y., Heberlein, U. High-resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila. J. Neurosci. 22, 11035-11044 (2002).
- Schumann, G., Spanagel, R., Mann, K. Candidate genes for alcohol dependence: Animal studies. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 27, 880-888 (2003).
- Singh, C. M., Heberlein, U. Genetic control of acute ethanol-induced behaviors in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 24, 1127-1136 (2000).
- Perreau-Lenz, S., Zghoul, T., de Fonseca, F. R., Spanagel, R., Bilbao, A. Circadian regulation of central ethanol sensitivity by the mPer2 gene. Addiction Biology. 14, 253-259 (2009).
- Brager, A. J., Prosser, R. A., Glass, J. D. Circadian and acamprosate modulation of elevated ethanol drinking in mPer2 clock gene mutant mice. Chronobiol. Int. 28, 664-672 (2011).
- Sinclair, J. D., Geller, I. Ethanol consumption by rats under different lighting conditions. Science. 175, 1143-1144 (1972).
- Danel, T., Jeanson, R., Touitou, Y. Temporal pattern in consumption of the first drink of the day in alcohol-dependent persons. Chronobiol. Int. 20, 1093-1102 (2003).
- Kapfhamer, D., et al. Taok2 controls behavioral response to ethanol in mice. Genes, brain, and behavior. 12 (1), 87-97 (2012).
- Lasek, A. W., et al. An evolutionary conserved role for anaplastic lymphoma kinase in behavioral responses to ethanol. PLoS One. 6, 226-236 (2011).
- Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
- Lyons, L. C., Roman, G. Circadian modulation of short-term memory in Drosophila. Learning & Memory. 16, 19-27 (2009).
- Hamblen-Coyle, M. J., Wheeler, D. A., Rutila, J. E., Rosbash, M., Hall, J. C. Behavior of period-altered circadian-rhythm mutants of Drosophila in ligh-dark cycles (Diptera Drosophilidae). J. Insect Behav. 5, 417-446 (1992).
- Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. Reciprocal behavior associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants. J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).
- Power, J. M., Ringo, J. M., Dowse, H. B. The effects of period mutations and light on the activity rhythms of Drosophila melanogaster. Journal of Biological Rhythms. 10, 267-280 (1995).
- Yoshii, T., et al. Temperature cycles drive Drosophila circadian oscillation in constant light that otherwise induces behavioural arrhythmicity. Eur. J. Neurosci. 22, 1176-1184 (2005).
- Berger, K. H., Heberlein, U., Moore, M. S. Rapid and chronic: two distinct forms of ethanol tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 28, 1469-1480 (2004).
- Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. Functional ethanol tolerance in Drosophila. Neuron. 28, 261-271 (2000).
- Kong, E. C., et al. Ethanol-regulated genes that contribute to ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 34, 302-316 (2010).
- Borycz, J., Borycz, J., Kubow, A., Lloyd, V., Meinertzhagen, I. Drosophila ABC transporter mutants white, brown and scarlet have altered contents and distribution of biogenic amines in the brain. J. Exp. Biol. 211, 3454-3466 (2008).
- Sitaraman, D., et al. Serotonin is necessary for place memory in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 5579-5584 (2008).
- Bainton, R. J., et al. Dopamine modulates acute responses to cocaine, nicotine and ethanol in Drosophila. Current Biology. 10, 187-194 (2000).
- Kong, E. C., et al. A pair of dopamine neurons target the D1-like dopamine receptor DopR in the central complex to promote ethanol-stimulated locomotion in Drosophila. Plos One. 5, (2010).
- Xu, J., Kochanek, K. D., Murphy, S. L., Tejada-Vera, B. . Deaths: Final data for 2007. , (2010).
- . The National Center on Addiction and Substance Abuse. Shoveling up II: The impact of substance abuse on federal, state and local budgets. , (2009).
- NIAAA, Estimated economic costs of alcohol abuse in the United States. , (1992).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction. Current Biology. 19, 2126-2132 (2009).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Addiction-like behavior in Drosophila. Communicative & Integrative Biology. 3, 357-359 (2010).
- Rodan, A. R., Rothenfluh, A. The genetics of behavioral alcohol responses in Drosophila. International Review of Neurobiology. 91, 25-51 (2010).
- Boothroyd, C. E., Young, M. W., Pfaff, D. W., Kieffer, B. Molecular and Biophysical Mechanisms of Arousal, Alertness, and Attention. Annals of the New York Academy of Sciences. 1129, 350-357 (2008).
- Nitabach, M. N., Taghert, P. H. Organization of the Drosophila circadian control circuit. Current Biology. 18, 84-93 (2008).
- Sheeba, V. The Drosophila melanogaster circadian pacemaker circuit. J. Genet. 87, 485-493 (2008).
- Cohan, F. M., Graf, J. -. D. Latitudinal cline in Drosophila melanogaster for knockdown resistance to ethanol fumes and for rates of response to selection for further resistance. Evolution. , 278-293 (1985).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
- Berger, K. H., et al. Ethanol sensitivity and tolerance in long-term memory mutants of Drosophila melanogaster. Alcohol Clin Exp Res. 32, 895-908 (2008).
- Pohl, J. B., et al. Circadian Genes Differentially Affect Tolerance to Ethanol. in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. , (2013).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33, 1794-1805 (2009).
- Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, (1016).
