におけるプロスタグランジンの抽出と分析<em>線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Summary

本稿では、プロスタグランジンや他のエイコサノイドからを抽出し、分析するために最適化された手順を説明<em> C.エレガンス</em> LC-MS/MSを用いた。

Abstract

線虫（Caenorhabditis elegans）は、脂質^1-9の生物学を研究するための強力な動物モデルとして浮上している。プロスタグランジンは、多価不飽和脂肪酸（PUFAは^）10-14由来脂質信号でエイコサノイドの重要なクラスである。これらのシグナル伝達分子が低いため豊かさと反応性の性質を研究することは困難である。プロスタグランジンの特徴は、脂肪酸の主鎖内に位置するシクロペンタン環構造である。哺乳類では、プロスタグランジンは、シクロオキシゲナーゼ酵素依存性および非依存性経路^10,15を貫通して形成することができる。℃でエレガンスは、シクロオキシゲナーゼ^6,16,17の独立したプロスタグランジンの広い配列を合成する。 Fシリーズのプロスタグランジンの大きなクラスは識別が、エイコサノイドの研究は、新しい発見の余地と早い段階にありました。ここでは、プロスタグランジンおよび他のエイコサノイドを抽出して分析するための手順を説明します。荷電脂質sが液 – 液抽出法を用いた質量ワーム培養物から抽出し、エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析（LC-ESI-MS/MS）に結合液体クロマトグラフィーによって分析する。内部標準などPGF ₂のようなプロスタグランジン_{、α-D 4}の重水素化類似体の包含は定量分析のために推奨されます。多重反応モニタリング又はMRMは、野生型および変異動物との間に特定のプロスタグランジンの種類を定量化して比較するために使用することができる。衝突誘起分解又はMS / MSは、重要な構造的特徴に関する情報を得ることができる。液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）は、 のm / z 315から360として選択された質量範囲の調査スキャンは、プロスタグランジンレベルのグローバル変化を評価するために使用することができる。我々はすべての3つの分析の例を示します。これらのメソッドは、新規エイコサノイドを発見し、その代謝経路の輪郭を描くためのツールセットを研究者に提供します。

Introduction

プロスタグランジン（PG類）は広く生物^12-14の広い配列に再生、免疫、および開発の調節に調査し、関与している脂質ホルモンの重要なクラスである。彼らは共通の前駆体（S）から派生した脂質のシリーズを構成するためのPGは、理想的には包括的なシステム生物学の分析に適しています。線虫C.エレガンスは、遺伝学とシステム生物学の基本的な質問に対処するために最も広く使用されているモデル生物の一つである。

私たちは、実証されていることでエレガンスは、FシリーズのPG類を合成し、その卵母細胞^3,6,16に精子ガイド。それぞれ3つ、4つ、5つの二重結合を含むF1、F2、およびF3クラスで20個のPUFAの由来のFシリーズのPGは^、3,16同定され^ている。これらのPGは、シクロオキシゲナーゼ酵素の独立した合成、まだ_PGF1αと_PGF2α立体異性体はまだGEあるさnerated。 Cの定性·定量分析のためのelegansの PGは、LC-MS/MSは、強力で高感度な分析手法である。この分析を実行する前に、分析プロセスの性能が大きくエキス品質に依存するため、最適化された抽出方法を開発することが重要である。液体クロマトグラフィーおよび質量分析は、比（m / z）を充電するために予想される質量、ならびにPG親イオンの望ましいピーク形状および保持時間を提供することができる。 CのPG類の代謝プロファイリングエレガンスは、様々なMSの買収戦略を必要とする困難な作業である。

LC-MSフルスキャンまたはアンケート走査（スキャンQ1）は、ほとんどのイオン化質量分析のPGは、応答を生成する保証するという利点を有する。サーベイスキャンは、野生型と変異型C.に関してのPG合計プロファイリングに関する有用な情報を提供していますがエレガンス 、マイナーPG類の検出は低感度のために危険にさらされます。いえ、以下、LC-MS調査走査のPGの全体像を与え、大きなPG集団の代謝に影響を及ぼすことが予想変異を分析するために特に有用であることができる。

代謝物の同定においては、化学的に合成された規格のPG LC-MS/MS分析は、最初の参照化合物としてのプロダクトイオンスペクトルを得るために行われる。これらのスペクトルは、未知の代謝物のスペクトルと比較することができる。多重反応モニタリング（MRM）モードが強化された感度および特異性のために使用される。 MRM実験は、化合物の親イオン/プロダクトイオン質量遷移を指定することによって達成される。標的分析物の質量と構造を知ることによって、それは多くの未知の代謝物の理論MRM遷移を予測することが可能である。

Cの異性体のPGをプロファイリングするための最適化されたLC-MS/MS法線虫は報告されていない。ここでは、LC-MSとからなる抽出および統合された質量分析アプローチを説明して、LC検出、定量化、 およびCを調査するためのMS / MSメソッドelegansの PG代謝物。このアプローチは、他のエイコサノイドに適用することができる。

Protocol

ワームの文化、プロスタグランジンの抽出、およびプロスタグランジンの分析：以下のように記述されたプロトコルは、次の3つのセクションに分かれています。上述のようにサンプルを一時的に-80°Cまたは-20℃で保存することができる場合に、複数のポイントがある 1。ワーム文化我々は包括的LC-MS/MSのための混合ステージワームの約6グラムをお勧めします。これは、検出、少なくとも6つの別々の注射のために十分な材料を提供する必要があります。単回注射または2つでMRMによって知らPG類の定量化、1-2 gで十分です。特定の段階からなる同期さ培養物からの抽出物の分析も可能である。最大4つの異なる株には同時に成長させることができる。例えば、野生型コントロール3つの異なる変異株。 補足給餌のために65（16 cm）のX-ラージNGMプレートと集中細菌を準備します。播種用NA22バクテリアを使用してください。補足給餌、GROのために濃縮された細菌を作成するにはW 16-24時間、LB培地でNA22の少なくとも4リットル。 M9バッファー100mlに、スピンダウンして上清を除去し、再懸細菌。この濃縮された細菌溶液200〜400mlをそれぞれウォーム株について必要とされ得る。 4℃で保存 5 X-ラージプレート上にワームの培養を開始します。プレートは妊娠成人のいっぱいになるまで約3〜4世代に渡ってワームを育てる。 （〜1ミリリットル/プレートと蓋を交換する前に、完全に乾燥させて）、必要に応じて、飢餓を防ぐために、濃縮された細菌は、プレートに追加する必要があります。 M9バッファーでプレートから妊娠雌雄同体を洗い、50 mlコニカルポリプロピレンチューブにワームを集める。 妊娠雌雄同体が下（通常は約3〜5分）に落ち着くことができます。細菌、卵、幼虫期のワームを含む上清を取り除きます。 15ミリリットルM9バッファーに再懸濁し、穏やかに混合する。 60シードNGMプレートのそれぞれにワームの懸濁液を200μlを移す。プレート全体でワームを分散させる。ワームソリューションは混在しておくよく、すべてのプレートまで、彼らはワームのほぼ等しい数値を受け取ることを保証するためにシードされています。 飢餓を防ぐために、必要に応じて濃縮された細菌とサプリメント（〜1 ml/plate/12〜24時間周期）。プレートは蓋を交換する前に空気乾燥させ。シードワームの元の数に応じて、2-4の世代のためにワームを育てたり、プレートは妊娠成人のいっぱいになるまで。 収穫のワームプレート一度に1株。 M9バッファーでプレートからワームを洗浄した50mlポリプロピレンチューブ（ 例えば、6管）で収集しています。プレートを洗浄するためにM9のバッファを使用し、その後、次のプレートにワームに満ちたバッファを転送します。プレートの数（ 例えば 10 番目 ） を洗浄した後、50ミリリットルチューブにワームに満ちたバッファを転送します。 M9バッファーで一番上にチューブを埋める。プレートの残りのための洗浄を繰り返します。 妊娠大人が5-6分で底に沈むように、上清（約35ミリリットル）を削除し、1つまたは2つのチューブに統合する。 FRで50 mlにチューブを埋めるESH M9バッファは、3〜5分間放置し、上澄み残し妊娠成人を削除しましょう​​。 3回繰り返したり、上清が透明になるまで。 大口径パスツールピペット、2を15mlポリプロピレン製コニカルチューブにできるだけ多くのワームなどの転送を使用。臨床遠心機で5分間1,000 RCF（CentraSL2で〜3,500 rpm）でスピンダウン。上清を除去し、すべてのワームを同じチューブに移して、ペレット化されるまで繰り返します。 -80℃で可能と店舗ワームなど多くの上澄みとして削除℃にすべての株について、この手順を繰り返します。 2。プロスタグランジンの抽出抽出のために必要な試薬を以下に示す。方法はゴロフコおよびマーフィー17のそれから変更及びLC-MS/MS感度を向上させる液液精製、続いてアセトン抽出を含む。同様の結果がダウンスホモジナイザーを得ることができるものの、弾丸ブレンダー5ホモジナイザーは、プロシージャで使用されている。ブチルhydroxytolueね（BHT）と窒素下で蒸発させ（N 2）ガスは、酸化を防止するために使用される。すべてのガラス製品は、脂質結合を減らすために（Sigmacote）シリコーン処理されるべきである。有機溶媒で抽出し、化学フード内で行われるべきである。 を50mlポリプロピレンコニカルチューブ重量を量る。 6.5ミリリットルマーク近くホットかみそりの刃で管を通って切断することによって-80℃で保存15ミリリットルコニカルチューブから冷凍ワームの約6.0グラムを転送します。メタノール洗浄しスパチュラは、管の底から凍結ウォームペレットを除去するために使用することができる。ペレットの上部から下部には、低密度幼虫ワームや残留細菌を取得するためにペレットを切断することで残されている。 予め秤量50ミリリットルコニカルチューブに凍結したワームを転送します。複数のサンプルが処理されている場合は、比較研究のために組織の同量（6.0 g）を使用する。ペースト状にワームの雪解けのように、所望の質量を得るために、へらでワームを追加または削除する。オプション：広告抽出効率のための内部統制としてPGF2α-D4規格のD 1.00 ngの。 ワームの懸濁液に0.005％のBHTと氷冷2時01アセトン/生理食塩水12ミリリットルを加え、ボルテックスでよく混ぜる。弾丸Blenderの使用のために12 5ミリリットル自立プラスチックチューブのそれぞれにワームスラリーの1.5ミリリットルを分注する。 セリアは、各5ミリリットルチューブに酸化ジルコニウムビーズを安定直径0.5mmの0.7〜0.8ミリリットルを追加します。しっかりとキャップを閉め、ブレットブレンダー5ホモジナイザーに12チューブをロードします。速度は8-9で3分間ブレンダーを実行し、氷の上でチューブを置きます。非常にしっかりとキャップを閉じ、またはコンテンツがこぼれることを確認してください。ステレオスコープを使用して、スライド上の1つの管からホモジネート10μlのを確認してください。残りのごく少数そのままワームがあるはずです。必要であれば、別の分のために同じ速度で繰り返します。 均等に9 "パスツールピペットを用いて4個の10 mlコニカルガラス管にホモジネートを移す。ビーズを転送することは避けてください。seque 3本のチューブから、ビーズを洗浄ntially 1時02アセトン/生理食塩水を含むBHT 1mlで。すべてのビーズを洗浄されるまで、他のチューブについて、この手順を繰り返します。を10mlのガラス管に残った溶液（約4 ml）を移し、氷の上に置きます。 4℃で10ミリリットルのガラス管を遠心℃で10分間〜1,000 xgで臨床遠心分離機でC。各チューブからクリーンの10mlガラスコニカルチューブに上清を移す。 化学フード中で、それぞれを10mlのガラス管に等量のヘキサンを加える。例えば、3.5ミリリットルアセトン/食塩水に3.5ミリリットルのヘキサンを追加します。 30秒最大速度でボルテックス。 4℃で10ミリリットルのガラス管を遠心℃で10分間〜1,000 xgで臨床遠心分離機でC。ヘキサンを含む上相と中性に荷電脂質を捨てる。 2 Mギ酸（ – 150μlの約100）を使用してpHを3.5に下相を酸性化。 pHのストリップを使用してpHをテストします。 各チューブに等量のクロロホルムを加える。 30秒最大速度でボルテックスと4でチューブを遠心°C I10分間〜1,000 xgでNA臨床遠心分離機。 上部の水相を取り外し、廃棄します。相間を避け、下クロロホルム相に残留乳白色の相間を通してピペットの先端を挿入します。新しい15 mlコニカルガラス管から4管のそれぞれから下相を収集します。少なくとも24時間、-20℃でインキュベートする。この時点で、抽出物は、最大2週間まで、-20℃で保存することができます。 冷凍庫からエキスを取り出し、存在する場合は、残りの乳白色の水性のトップ層を捨てる。新しいパスツールピペットを用いて標識テフロン並ん½-ドラムのガラスバイアルにクロロホルム相を転送します。化学フードでは、N 2ガ ​​スの穏やかな流れの下で乾燥するまでクロロホルム可溶性画分を蒸発させる。乾燥した抽出物は、最大2週間まで、-20℃で保存することができます。 PG抽出および分析のために使用される全体的なスキームを図1に示されている。 3。プロスタグランジンの分析株式を準備ワーキング溶液を調製し、水（8:2 v / v）の：そのようなPGF2αまたはPGF 2メタノール中α-D4（1μgの/ ml）のように、メタノールで希釈し、個々の基準プロスタグランジンのソリューションを提供しています。標準曲線を生成するために希釈系列（100、10、1、0.1、0.01 ngの/ ml）を調製する。 乾燥されたCに水（8:2 v / v）の：200μlのメタノールを追加elegansの脂質抽出物（s）と徹底的に混ぜる。水溶液：ワーム組織未満の6グラムが抽出された場合は、乾燥された抽出物をメタノールの少ないボリュームに再懸濁させなければならない。 水中0.1％ギ酸からなる移動相を調製[A]、0.1％ギ酸を含むアセトニトリル[B]。 4℃でオートサンプラを設定し、70カウント1.5 mlのバイアルラックにサンプルバイアルを置きます。 約5分間で0.2ミリリットル/分の流速で、0.1％ギ酸とのシナジーハイドロRP-C18カラムを平衡化する。 カラムにサンプル（20-50μL）を注入します。グラジエント溶出スタートを実行り、10％Bで0-11分と、11〜14分で80から100パーセントのBから80％のBまで行くと16分で10％Bに戻っ。合計実行時間は20分である。 13標準品の保持時間は、基準3は、表1に示す。 負イオンモードで動作してESIインターフェースを使用して質量分析計へ流出列を導入する。窒素は、ネブライザー、カーテンガス（CUR = 10）として使用される。衝突ガス、衝突エネルギー、および温度は、それぞれ、10、-35 eVで、600°Cに設定されている。デクラスタリング電位（DP）、衝突エネルギー（CE）、および細胞出口電位（CXP）は、それぞれ、-90、-35、-10に設定されている。 調査スキャン（Q1スキャン）の場合は、ほとんどのPGは（ 図2） のm / z 315から360までの質量範囲でマイナスイオンモードを使用します。範囲は、関心のある化合物の質量に応じて、変更することができる。 LC-MSイオンクロマトグラムの総イオン電流（TIC）からイオンを抽出し、抽かどうかを判断するテッドイオンが脱プロトン化又は付加物イオンに相当する、またはフラグメントイオンに関する。 MRM実験では、質量遷移のためのm / z 311分の355はF1クラスを検出するために使用され、 のm / z 193分の353 F2クラスに使用され、およびm / zの 193分の351又は191分の351は、F3クラスのために使用され（ 図3）。 MRMは、内部標準（例えば、 のm / z 197分の357 PGF2α-d4のために）検出し、標準曲線を生成するために使用される。マーフィーらを参照してください。PG質量遷移18に関する追加情報。 MS / MS実験では、F1クラスのm / z 353for F2クラス、およびm / zの 351for F3クラスPGのためのm / z 355を使用しています。Cで FシリーズPGのためのエレガンス MS / MSデータを図4および表2 3,16で利用可能です。哺乳類エイコサノイド用MS / MSデータがで利用可能ですwww.lipidmaps.org 。 Analysを使用して分析データを処理Tソフトウェア（バージョン1.4.2、アプライドバイオシステムズ社）。

Representative Results

試料調製はゴロフコとマーフィー17から適応液-液抽出を行った。これは、内部標準（PGF2α-D4）の優れた回復を提供した。 CからPGを抽出するための一般的なスキーム線虫は、 図1に示されている。クロマトグラフィー条件は> 30エイコサノイド基準（ 表1は 13規格を示す）のベースライン分離を提供するために最適化された。 0.1％ギ酸を含む水とアセトニトリルとハイドロ-RPカラム（250×2.0ミリメートルidは）最良の分離と感度を提供しました。野生型および脂肪3変異体抽出物の調査スキャンは315から360原子質量単位の質量範囲でイオンの図2文書グローバルレベルに示す。 脂肪-3（WA22）変異体はほとんどの20 -炭素のPUFAを欠いている。 F3クラスPGが強調表示されます。 図3では、野生型抽出物のMRM分析は、F1（ 図3Aの複数のPG異性体を示す</stro>）、F2（ 図3B）、およびF3（ 図3Cおよび3D）クラス。 F3クラスは、2つの質量遷移のm / z 193分の351またはm / zの 191分の351のいずれかを検出することができる。 CePGF2は主にPGF2αの鏡像異性体で構成されています。 CePGF1はPGF1αまたはその鏡像異性体である可能性が高い。 図4に示すCePGF2の衝突誘起分解（RT = 11.8）PGF2α標準（RT = 11.8）と比較。プロダクトイオンのわずかな違いは、おそらく抽出物中の低CePGF2豊富と共溶出化合物によるものである。 図1。 C.の概略図エレガンス PGは抽出とLC-MS分析 。両方の脂質酸化を最小限に抑えるための0.005％のBHTを持つアセトン/生理食塩水及びクロロホルムことに注意してください。詳細については、テキストを参照してください。https://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig1large.jpg "ターゲット=" _blank ">より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください。 図2。野生型のm / z 315から360と脂肪-3（WA22）変異体抽出物の調査をスキャンします。液体クロマトグラフィーの保持時間（RT）がパネルに表示されます[A]。 RT = 11.3で抽出されたイオンは、野生型[B]と脂肪-3（WA22）[C]抽出のために示されている。質量のm / z 351とF3クラスPGが強調表示されます。 CPS、カウント/秒; AMU、原子質量単位。 イチジクURE 3。野生型の抽出物のMRM分析。F1クラスPGは、質量移行のm / z 311分の355 [A]で検出されています。 PGはなさそうであり、いくつかの疎水性化合物（RT> 14分）にも、この移行で検出されていることに注意してください。 F2クラスPGは、質量移行のm / z 193分の353で検出されている[B]。 F3クラスPGは、質量移行のm / z 193分の351のいずれかで検出された[C]またはm / zの 191分の351 [D]。抽出物はそれぞれのクラスの複数のPG異性体を含んでいることに注意してください。番号は、 表2に示すのPGに相当する。 CePGF2の濃度は1.8 ngの/ mlである。 RT、保持時間、CPS、カウント/秒。 図4。化学的にシンセの衝突誘起分解PGF2αとCePGF2 esized。パネルの矢印[A] PGF2αとCePGF2（RT = 11.8）との間で共有され、製品や断片化イオンを示す。 のm / z 309およびm / zの193のプロダクトイオンが示された構造に対応して指定された切断部位（aとb強調）から生成され、F-シリーズのPGの特徴である[B]。さCPS、カウント/秒。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。 標準 RT（分） [MH] – のm / z MS / MSでキー生成イオン 20 -ヒドロキシPGE 2 9.43 367 349、331、287、234、189、129、109 </tr> PGF 3 – 11.26 351 333、307、289、271、245、219、209、193、191、171、165、111 トロンボキサンB 2 11.66 369 289、191、177、169、151 PGF 2 – 11.80 353 335、309、291、273、263、247、235、209、193、171、165、111 PGF 1 – 11.79 355 337、319311、301、293​​、275、265、237、211、195 リポキシンB 4 12.38 351 201、191189、165、155、115、107、71、59 PGD ​​2 12.56 351 315、271203、189 5（S）、6（R） -リポキシン4 12.83 351 235、217、189、144、135、115、99、59 PGA 2 14.02 333 315、297、271、235、191、189、175、163、137、113、109 Δ12-PGJ 2 14.20 333 271、189、123 ロイコトリエンB 4 14.73 335 181、109、93、71、69、59、57 15D-Δ12,14-PGJ 2 16.80 315 297、271、217、203、158 5（S）-HpETE 17.88 335 97、83、81、57 表1。保持時間とLC-MS/MS法 3 から13エイコサノイド基準の主要なプロダクトイオン 。 30以上の基準はLC-MS/MSプログラムを開発するために使用された。クロマトグラフィーの保持時間（RTS）はさえ非常に似ているPGの間で、異なる。例外はPGF1αとPGF2αです。それにもかかわらず、これらのPGは、Dです（ – のm / z [MH]）と衝突誘起分解スペクトル（MS / MS）親イオン質量によってistinguished。 プロスタグランクラス 図3の番号 [MH] – のm / z MS / MSでキー生成イオン F1（CePGF1） 1 355 319、301、311、293​​、275、265、237、223、211、195、157 F1 2 355 311、301、293​​、275、265、211、195、167、157 F2（CePGF2） 3 353 309、291、273、263、247、209、193、171、165、127 F2 4 353 309、291、273、263、255、247、219、209、193、171、113 F3 5 351 315、307、289、275、249、205、193、191、167、153、139 F3 6 351 333、289、271、261、245、223、193、191、163 表2。いくつかの主要なCの衝突誘起分解生成イオン虫 F1、F2、およびF3のPGは、図3に示す 。他のあまり豊富な異性体のMS / MS示されていない。これらのデータは、複数の分析からのものではなく、すべてのプロダクトイオンは、指定されたランに見えるかもしれません。抽出物の複雑さを考えると、いくつかのより少なく豊富なプロダクトイオンは、干渉から同様の保持時間または結果を持つ別の親イオンから導出してもよい。ピーク2は、おそらくCePGF2の立体異性体である可能性が高いCePGF1とピーク4の立体異性体である。追加データ3用エドモンズら （2010）を参照してください。

Discussion

私たちは、FシリーズPGのに焦点を当て、エイコサノイド抽出および分析のための手順を説明します。問題となる可能性がある手順のいくつかの部分があります。まず最初に、それは飢餓がPG代謝を変えることができますようにワームの文化が、餓死しないことが重要です。 NA22は、より高い密度に達したので、補足的な給餌の場合、NA22細菌がより一般的に使用さOP50細菌の代わりに推奨されています。しかし、NA22株は抗生物質耐性を欠き、汚染を受けやすい。第二に、ワームは、哺乳動物の組織に比べて低濃度では、個々のPG異性体を合成する。これは部分的に、多数の異性間の冗長性に起因することがあります。我々は包括的な分析と強い信号のための組織の約6グラムをお勧めします。 PG濃度を増加させる水溶液：乾燥した抽出物を減らすメタノール中に再懸濁されている場合より少ない組織（1-2 g）を用いることができる。しかし、1〜2回の注射を行うことができる。我々のLC-MS/MS系の検出限界は10 pgの程度である_PGF2α/ mlの。密集混在ステージワームの一つミリリットル（約1g）がCePGF2の約25-50 pgのが得られます。より高感度な質量分析システムは、分析に必要なウォーム組織の量を低減することができる。第三に、サンプル間のPG抽出効率の違いは、変数の結果を引き起こす可能性があります。我々は、組織を並列に抽出する際の抽出効率は非常に類似していることを見出した。効率性を判断するには、内部統制などの均質化工程で_{PGF2α-D 4}の1.0 ngのを追加します。質量遷移のm / z 197分の357を使用して、MRMは1 ngの/ mlの標準溶液に対して_PGF2α-d4の濃度を測定するために使用される。抽出中に失われた_PGF2α-dの₄の量を算出する。

我々が含むクロマトグラフィパラメータおよび質量遷移は、他のPGとエイコサノイドを検出するように変更することができる。かなりの努力にもかかわらず、我々は、D-シリーズまたはE-SERを識別することができていないIESは抽出¹⁷ PGS。さらに、我々はPG立体異性体¹⁹の非選択的な混合物を生成し、フリーラジカル開始過酸化、の特徴である8 -イソ_PGF2αと8 -イソPGE _2を検出していない。ワームは、他のPG型を合成するかどうかは不明である。カンナビノイドとアラキドンとエイコサペンタエン酸の様々なエポキシ樹脂とヒドロキシ代謝物はCで発見されている虫は ^5,7,20,21を抽出します。我々はそれぞれ、定量と同定のための本格的な標準規格に比べMRMとMS / MSの両方の使用をお勧めします。小説エイコサノイドの場合は、これらの分析が可能であれば、PUFA合成酵素²²と同様に、機能アッセイに欠損している変異体脂肪の比較研究と組み合わせる必要がある。 脂肪変異体を分析する注意点は、ワームに存在するPUFAの微量はPG合成のために十分であるということです。例えば、 脂肪-2（wa17）変異体D12デサチュラーゼ活性を少量（野生型^22〜5％）があり、これらの変異体は、まだPGの^6を生成する。 脂肪-3（WA22）と脂肪-4（WA14）変異体はアラキドン由来のPGとエイコサペンタエン酸^16を合成するために失敗する。我々はまた、 脂肪変異体が残りのクラスからアップレギュレートPG合成によるPUFAクラスの損失を補償することを見出した。例えば、 脂肪3（WA22）変異体は、20 -炭素のPUFA由来最もPG類を合成するために失敗する。代わりに、彼らは、18 -炭素PUFAは¹⁶由来の新規のPG類をアップレギュレートするように見える。これまでに、我々はCを確認されていませんPG合成を完全に欠損しているエレガンス株 。また、PGは、成長や開発に必須であることが可能である。

Materials

			REAGENTS
X-large (16 cm) plates	Fisher Scientific	0875714
E. coli strain NA22	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	NA22	http://www.cgc.cbs.umn.edu
Acetone, 399.5%	Fisher Scientific	A928-4
Butylated Hydroxytoluene	MP Biomedicals	101162
Hexane, HPLC grade	Fisher Scientific	H302-1
Formic acid, 399%	Acros	AC27048-0010	Available through Fisher Scientific
Chloroform, HPLC grade	Acros	AC26832-0010	Available through Fisher Scientific
PGF2α-d4	Cayman Chemicals	316010	Cayman has a wide array of standards available for purchase
Sterile screw cap self-standing 5 ml tube	Fisher Scientific	14-222-651	For use with Bullet Blender
0.5 mm zirconium oxide beads	Next >>> Advance	ZrOB05
10 ml glass conical heavy-duty graduated centrifuge tubes	Kimble Kimax	45200-10	Available through Fisher Scientific
15 ml glass conical tubes	Corning Pyrex	8082-15	Available through Fisher Scientific
Sigmacote (Siliconizing reagent)	Sigma-Aldrich	SL2-100ML
Teflon lined capped 1/2 Dram glass vial	Fisher Scientific	V1235C-TFE
			EQUIPMENT
CentraSL2 Clinical Centrifuge	Thomas Scientific	2517N92-TS
Bullet Blender 5 blue homogenizer	Next >>> Advance	BBY5MB	A 40 ml Dounce homogenizer can be used as an alternative
Synergi 4 μm Hydro-RP 80 Å LC Column 250 x 2.0 mm	Phenomenenex	00G-4375-B0	HPLC Column
SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm	Phenomenenex	AJ0-7510
SecurityGuard Guard Cartridges Kit	Phenomenenex	KJ0-4282
Shimadzu Prominence HPLC with refrigerated auto sampler	Shimadzu Scientific Instruments, Inc.		Any standard HPLC system coupled to a triple quadrupole mass spectrometer should be sufficient
API 4000 triple quadrupole mass spectrometer	Applied Biosystems/MDS SCIEX
			M9 buffer recipe (4 liter) 12 g KH2PO4 24 g Na2HPO4 20 g NaCl Up to 4 liter Deionized water Aliquot to eight 1 liter bottles. Autoclave and cool. 0.5 ml/bottle 1 M MgSO4