I denna uppsats beskriver vi en optimerad procedur för att extrahera och analysera prostaglandiner och andra eikosanoider från<em> C. elegans</em> Hjälp LC-MS/MS.
Caenorhabditis elegans framstår som en kraftfull djurmodell för att studera biologi lipider 1-9. Prostaglandiner är en viktig klass av eikosanoider, som är lipid signaler som härrör från fleromättade fettsyror (PUFA) 10-14. Dessa signalmolekyler är svåra att studera på grund av deras låga förekomst och reaktiv karaktär. Det karaktäristiska för prostaglandiner är en cyklopentanring struktur ligger inom fettsyran ryggraden. Hos däggdjur kan prostaglandiner bildas genom Cyklooxygenasenzymet-beroende och-oberoende vägar 10,15. C. elegans syntetiserar ett brett utbud av prostaglandiner oberoende av cyklooxygenaser 6,16,17. En stor klass av F-serien prostaglandiner har identifierats, men studier av eikosanoider är i ett tidigt skede med gott om plats för nya upptäckter. Här beskriver vi ett förfarande för att extrahera och analysera prostaglandiner och andra eikosanoider. Laddad lipids utvinns från samlas mask odlingar med användning av en vätske-vätske-extraktionsteknik och analyserades med vätskekromatografi kopplad till elektrosprayjonisering tandemmasspektrometri (LC-ESI-MS/MS). Införandet av deutererade analoger av prostaglandiner, såsom PGF 2 α-d4 som inre standard rekommenderas för kvantitativ analys. Flera reaktion övervakning eller MRM kan användas för att kvantifiera och jämföra specifika prostaglandin typer mellan vildtyp och muterade djur. Kollision-inducerad nedbrytning eller MS / MS kan användas för att få information om viktiga strukturella drag. Vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS) undersökning skanningar av ett valt massområde, såsom m / z 315 till 360 kan användas för att utvärdera globala förändringar i prostaglandin nivåer. Vi ger exempel på alla tre analyser. Dessa metoder kommer att ge forskare med ett verktyg för att upptäcka nya eikosanoider och avgränsar deras metaboliska vägar.
Prostaglandiner (PG) är en viktig klass av lipid hormoner som har undersökts och inblandad i regleringen av reproduktionen, immunitet och utveckling i ett brett spektrum av organismer 12-14. PGs är idealiskt lämpade för omfattande systembiologiska analyser eftersom de innefatta en serie av lipider härledda från en gemensam prekursor (er). Nematoden C. elegans är en av de mest använda modellorganismer för att ta itu med grundläggande frågor i genetik och systembiologi.
Vi har visat att C. elegans syntetiserar F-seriens PG som styr rörliga spermier till oocyter 3,6,16. F-seriens PG härledda från 20-kol PUFAs med tre, fyra och fem dubbelbindningar, innefattande F1, F2, och F3 klasser, respektive har identifierats 3,16. Dessa PGs syntetiseras oberoende av cyklooxygenas enzymer, men PGF 1α och PGF 2α stereoisomerer är fortfarande GEnerated. För kvalitativa och kvantitativa analyser av C. elegans PGs är LC-MS/MS en kraftfull och känslig analysteknik. Innan denna analys, är det viktigt att utveckla en optimerad extraktion metod eftersom utförandet av den analytiska processen starkt beroende av extraktet kvalitet. Vätskekromatografi och masspektrometri kan endast ge förutses massa till laddningsförhållande (m / z), såväl som önskvärda toppform och retentionstid av PG moderjonen. Metabola profilering av PG i C. elegans är en utmanande uppgift som kräver olika MS förvärv strategier.
LC-MS fullständig genomsökning eller undersökning skanning (Q1 scanning) har fördelen att de joniserbara PGs kommer att generera en masspektrometrisk svar. Medan undersökningen scan ger användbar information om total profilering av PGs med avseende på vildtyp och mutant C. elegans, detektering av mindre PGs är nedsatt på grund av låg känslighet. Icke destomindre, kan LC-MS undersökning skanning ger en samlad bild av PGs och är särskilt användbart för att analysera mutanter förutspås påverka metabolismen av ett stort PG befolkning.
I metabolit identifiering, är LC-MS/MS analys av kemiskt syntetiserade PG standarder uruppfördes att få deras spektra produkt jon som referensföreningar. Dessa spektra kan jämföras med det spektrum av en okänd metabolit. Flera reaktion övervakning (MRM)-läget används för ökad känslighet och specificitet. En MRM experiment åstadkoms genom att ange moderjonen / produkt övergång jonmassan av en förening. Genom att veta massan och strukturen på målanalyter, är det möjligt att förutsäga teoretiska MRM övergångar för många okända metaboliter.
En optimerad LC-MS/MS metod för profilering isomera PGs i C. elegans har inte rapporterats. Här beskriver vi en extraktion och integrerad masspektrometri tillvägagångssätt bestående av LC-MS-och LC-MS / MS-metoder för detektion, kvantifiering och utreda C. elegans PG metaboliter. Denna metod kan tillämpas på andra eikosanoider.
Vi beskriver ett förfarande för eikosanoid extraktion och analys, med fokus på F-seriens PG. Det finns flera delar av förfarandet som kan vara problematisk. Först är det viktigt att masken kulturer inte svälta, eftersom svält kan förändra PG metabolism. För kompletterande utfodring, är NA22 bakterier rekommenderas i stället för de vanligaste OP50 bakterier eftersom NA22 når högre densitet. Dock saknar NA22 stammen antibiotikaresistens och är mer mottagliga för kontaminering. Det andra, maskar syntetisera enskilda PG isomerer i låg förekomst i förhållande till däggdjursvävnader. Detta kan delvis bero på att övertalighet bland de många isomerer. Vi rekommenderar ca 6 g vävnad för omfattande analys och starkare signaler. Mindre vävnad (1-2 g) kan användas om det torkade extraktet återsuspenderas i mindre metanol: vatten lösning för att öka PG koncentration. Dock kan endast en till två injektioner utföras. Detektionsgränsen för vårt LC-MS/MS systemet är ca 10 pgPGF 2α / ml. En ml av tätt packade blandade stadium maskar (ca 1 g) ger ungefär 25-50 pg av CePGF2. Mer känsliga masspektrometri system kan minska mängden av masken vävnad som erfordras för analys. Tredje, kan skillnader i PG extraktionsverkan bland prover orsaka varierande resultat. Vi har funnit att extraktionseffektivitet är mycket lika när vävnader extraheras parallellt. För att bestämma effektiviteten, tillsätt 1,0 ng PGF 2α-d4 vid homogeniseringssteget som en intern kontroll. MRM användning av mass-övergång m / z 357/197 används för att mäta PGF 2α-d4 koncentration i förhållande till en 1 ng / ml standardlösning. Mängden PGF 2α-d4 förlorad under extraktion beräknas sedan.
De kromatografiska parametrarna och övergångar massa vi inkludera kan ändras för att upptäcka andra PGs och eikosanoider. Trots stora ansträngningar har vi inte kunnat identifiera D-serien eller E-Sertalet PGS i extrakten 17. Vidare har vi upptäckt inte 8-iso PGF 2α och 8-iso PGE 2 som är karakteristiska för fri radikal-initierad peroxidation, som alstrar ett icke-selektivt blandning av PG stereoisomerer 19. Vare maskar syntetisera andra PG typer är inte känd. Endocannabinoids och olika epoxi och hydroxy metaboliter av arakidonsyra och eikosapentaensyra syror har hittats i C. elegans extraherar 5,7,20,21. Vi rekommenderar användning av både MRM-och MS / MS jämfört med autentiska standarder för kvantifiering och identifiering, respektive. För nya eikosanoider, bör dessa analyser kombineras med en jämförande studie av fett mutanter, som har brist på PUFA syntetiserande enzymer 22, samt en funktionell analys, om möjligt. En varning för att analysera fett mutanter är att små mängder av PUFA finns i maskar är tillräckliga för PG-syntes. Till exempel, fett-2 (wa17) mutanterhar en liten mängd av D12 desaturasaktivitet (~ 5% av vild typ 22) och dessa mutanter fortfarande producera PGs 6. fett-3 (wa22) och fett-4 (WA14) mutanter misslyckas med att syntetisera PGs härledda från arakidonsyra och eikosapentaensyra syror 16 . Vi har också funnit att fett mutanter kompensera för förlusten av PUFA klasser med upp-reglera PG syntes från övriga klasser. Till exempel, fett-3 (wa22) mutanter misslyckas med att syntetisera de flesta PGs härrör från 20-kol PUFA. Istället verkar de upp-reglera nya PGs härrör från 18-carbon PUFAs 16. Hittills har vi inte identifierat ett C. elegans stam som är helt bristfällig i PG-syntes. Det är möjligt att PGs är väsentliga för tillväxten eller utvecklingen.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar de UAB Riktade Metabolomics och proteomik Laboratory, som har stöd i del av UAB Skin Disease Research Center (P30 AR050948 till C. Elmets), UAB-UCSD O'Brien Acute Kidney Injury Center (P30 DK079337 till A. Agarwal ) och UAB Lung Health Center (R01 HL114439, R01 HL110950 till JE Blalock). Stöd för masspektrometer var från en NCRR Shared Instrumentation bidrag (S10 RR19261 till S. Barnes). Vi tackar även Ray Moore för teknisk support. C. elegans stammar lämnades av Caenorhabditis Genetics Center, som finansieras av NIH. Detta arbete stöddes av NIH (R01GM085105 till MAM, inklusive en Arra administrativ tillägg).
REAGENTS | |||||||||||||||||
X-large (16 cm) plates | Fisher Scientific | 0875714 | |||||||||||||||
E. coli strain NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | NA22 | http://www.cgc.cbs.umn.edu | ||||||||||||||
Acetone, 399.5% | Fisher Scientific | A928-4 | |||||||||||||||
Butylated Hydroxytoluene | MP Biomedicals | 101162 | |||||||||||||||
Hexane, HPLC grade | Fisher Scientific | H302-1 | |||||||||||||||
Formic acid, 399% | Acros | AC27048-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
Chloroform, HPLC grade | Acros | AC26832-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
PGF2α-d4 | Cayman Chemicals | 316010 | Cayman has a wide array of standards available for purchase | ||||||||||||||
Sterile screw cap self-standing 5 ml tube | Fisher Scientific | 14-222-651 | For use with Bullet Blender | ||||||||||||||
0.5 mm zirconium oxide beads | Next >>> Advance | ZrOB05 | |||||||||||||||
10 ml glass conical heavy-duty graduated centrifuge tubes | Kimble Kimax | 45200-10 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
15 ml glass conical tubes | Corning Pyrex | 8082-15 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
Sigmacote (Siliconizing reagent) | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |||||||||||||||
Teflon lined capped 1/2 Dram glass vial | Fisher Scientific | V1235C-TFE | |||||||||||||||
EQUIPMENT | |||||||||||||||||
CentraSL2 Clinical Centrifuge | Thomas Scientific | 2517N92-TS | |||||||||||||||
Bullet Blender 5 blue homogenizer | Next >>> Advance | BBY5MB | A 40 ml Dounce homogenizer can be used as an alternative | ||||||||||||||
Synergi 4 μm Hydro-RP 80 Å LC Column 250 x 2.0 mm | Phenomenenex | 00G-4375-B0 | HPLC Column | ||||||||||||||
SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm | Phenomenenex | AJ0-7510 | |||||||||||||||
SecurityGuard Guard Cartridges Kit | Phenomenenex | KJ0-4282 | |||||||||||||||
Shimadzu Prominence HPLC with refrigerated auto sampler | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | Any standard HPLC system coupled to a triple quadrupole mass spectrometer should be sufficient | |||||||||||||||
API 4000 triple quadrupole mass spectrometer | Applied Biosystems/MDS SCIEX | ||||||||||||||||
|