최근 몇 년 동안 체외 배양 방법에서 사용하는 생식 세포의 형성은 체세포 줄기 세포의 여러 가지 유형을 사용하여 증명되었습니다. 이 문서에서는 시각적으로 초기 난 모세포 – 유사 세포로 신생아 마우스 유래 줄기 세포의 분화를 발표 할 예정이다.
Abstract
생식 세포의 형성과 분화를 연구하는 것은 전통적으로 낮은 세포 수 및 개발 배아에서 깊은 자신의 위치로 인해 매우 어려운 일이다. 체외 기반 시스템에서 "폐쇄"의 여부는 배우자 형성에 대한 우리의 이해를 위해 매우 유용 할 수 있습니다. 신생아 마우스 피부에서 고립 된 체세포 줄기 세포에서 난자 세포와 같은 (OLCs)의 형성이 입증되었으며,이 비디오 프로토콜 시각화 할 수 있습니다. 결과 OLCs는 OCT4, 바사, Bmp15 및 Scp3으로 난자와 일치 다양한 마커를 표현한다. 그러나, 그들은 성숙 또는 감수 분열을 완료하는 데 오류로 인해 수정을받을 수없는 남아 있습니다. 이 프로토콜은 더 성숙한 배우자로 생식 세포의 초기 형성과 분화를 연구하는 데 유용 시스템을 제공합니다. 초기 분화 OCT4을 표현하는 세포의 수 (잠재적 인 생식 세포와 같은)하지만 현재 F를 ~ 5 %에 도달OLCs의 ormation은 상대적으로 비효율적 남아있다. 특별한주의가 시작 세포 인구가 건강하고 초기 통로이다 않도록주의해야하지만 프로토콜은 비교적 똑바로 앞으로이다.
Introduction
초기 배아 발생 동안, 배우자 형성은 원시 생식 세포 (PGC) 형성, 마이그레이션 및 생식 능선의 마지막으로 식민지 등 일련의 단계를 통해 발생합니다. 이 시간 동안 PGCs는 점점 더 성숙 배우자 1에 증식과 분화를 겪는다. PGCs는 배아 hindgut에 allantois의 기지에서 마침내 결국 생식 능선을 식민지화 등의 벽을 따라 마이그레이션하는 것이 사실은 2 공부하기가 대단히 어렵다. 분야의 발전에도 불구하고, PGC 형성과 분화를 이해하려는 연구들은 제한된 수의 위치 및 철새 성격 3,4에 의해 방해되었다.
최근 배아 줄기 세포는 체외 5,6에서 생식 세포를 형성 할 수있는 잠재력을 가지고 보여왔다. 마찬가지로, 여러 체세포 줄기 세포는 배아 세포가 FOLL 형성 할 수있는 잠재력을 가지고 표시되었습니다체외 배양 7-11 때문에. 최근 신생아 쥐의 피부에서 분리 된 줄기 세포 배아 같은 세포와 초기 단계의 난자를 12으로체외에서 분화되었다. 분화 OCT4을 표현하는 줄기 세포의 집합이 증가하고 구조를 닮은 적운-난자 복합체가 형성되었다. 난 모세포와 같은 세포 (OLCs) 문화에서 고른 자연 난자에 비교할 수 있습니다. 40-45 μm의 측정이 문화 방법 OLCs를 사용하면 얻을 수있다 그러한 Gdf9b, VASA 및 DAZL으로 난자에 명시 유사한 표식입니다. 최신 결과 OLCs 12 성숙하거나 기름지게 할 수없는 남아 있습니다.
OLCs이 OLCs을 형성하는 데 사용되는 프로토콜은 여전히 내 초기 단계의 생식 세포의 형성과 발전을 연구하는 분석으로 유틸리티가 작동하지 않을 수없는 남아 있지만, 체외 시스템에 마감했다. 그래서에서 OLCs의 형성을 논의 출판물매틱 줄기 세포는 줄기 세포 소스 8로 태아의 돼지 피부를 활용. 유도 분화 초기에 형성된 PGC와 같은 세포, OCT4로 OLCs을 표현 같은 PGC 마커에 VASA, STELLA, C-KIT, 그리고 DAZL 13 전구체로 표시되었던 연구를 확대. 이 데이터는 체외에서 생식 세포의 형성과 분화를 연구하기 위해이 시스템을 활용하는 가능성을 지원합니다. 신생아 쥐의 피부에서 OLCs를 형성하기 위해 이용되는 프로토콜이 비디오 문서에서 설명 될 것입니다. 이 프로토콜은 자신의 증식과 분화 요인이 중요한 명료하게하는 수단을 제공 할 수 생식 세포 발달을 연구하는 체외 모델을 제공합니다.
Protocol
1. 미디어 준비 실험이 진행되는 세포 배양 인큐베이터에서 느슨해 캡 사용 및 장소를 사전에 용지 2 ~ 3 시간을 준비합니다. 본 프로토콜에서 사용 미디어 : 1 개 B27, 40 NG / ML bFGF를, 20 NG / ML EGF와 보충 DMEM/F12로 구성된 세포 매체를 줄기 준비한다. 0.05 IU의 FSH, 0.03 IU LH, 3 MG / ML BSA, 5 μL / ㎖ ITS, 0.23 mM의 나트륨 피루 베이트, 1 MG / ML Fetuin, 1 NG / ML EGF와 보충 M199로 구성된 생식 세포 …
Representative Results
처음에는 세포가 배양 접시 바닥에 부착 확산. 차별화에 42-72 시간에 작은 정지 OCT4 양성 세포가 형성하고 (그림 1A) 확산. 곧 이러한 세포의 시각화 후 대부분 사라지고 첨부 된 세포 배양 하단에 밀도 식민지 집계를 형성합니다. 몇 일 다음이 집계 문화 표면에서 분리합니다. 이러한 골재의 일부 대형 세포 (그림 1B 및 1C) 관찰 할 수있다. 초기 구상에 따라 세포…
Discussion
기능 OLCs 날짜를하려면 생체 분석에 완벽을 사용하여 개발되지 않았습니다. 최근 하야시 외 의해 연구. 체외에서 형성되고 발전 14생체 내에서 전송되는 세포 PGC 같은에서 자손을 생산할 수 있었다. 그들은 생체 이식 후 회복, 세포처럼 PGC를 형성 할 수 있었다 ES 세포 나 유도 만능 세포로 시작은 성숙 시비, 자손 14를 생성하는 데 사용 될 수 있었?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PWD 웨스턴 대학의 제럴드 M. 키더에 건강 연구 교제 (CIHR)와 CIHR 부여의 캐나다 연구소에 의해 지원됩니다. 저자는 여기에 제시 프로토콜의 개발에 도움을 구 엘프 대학에서 Julang 리를 인정하고 싶습니다.
Dyce, P. W. Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro. J. Vis. Exp. (77), e50486, doi:10.3791/50486 (2013).