遺伝子発現のDNA相互作用、ディスカバー転写レギュレータ、および新規抗腫瘍剤を同定：タンパク質を研究するために、定量的アッセイ
Summary
我々は、DNAと転写因子との相互作用を測定するための定量的なDNA結合性、ELISAベースのアッセイを開発した。 RUNX2タンパク質に対して高い特異性は、コンセンサスDNA認識オリゴヌクレオチドと特異的モノクローナル抗体を用いて達成された。酵素結合抗体基質反応と比色検出をリアルタイムでモニターした。
Abstract
このような電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）、化学発光アッセイ、クロマチン免疫沈降法（ChIP）に基づくアッセイ、およびマルチウェルベースのアッセイなどの多くのDNA結合アッセイは、転写因子活性を測定するために使用される。しかしながら、これらのアッセイは、非定量的である特異性を欠いている、放射性標識オリゴヌクレオチドの使用を含み得る、DNAおよび結合の阻害剤のスクリーニングに適用可能でなくてもよい。一方、定量的DNA結合酵素結合免疫吸着アッセイ（D-ELISA）アッセイを用いて、我々は、ビオチンに存在するコンセンサスDNA結合配列と特異的会合に依存RUNX2転写因子を用いてDNAを有する核タンパク質相互作用を実証する標識されたオリゴヌクレオチド。細胞は、核タンパク質の抽出、および二本鎖オリゴヌクレオチドの設計の調製が記載されている。アビジン被覆96ウェルプレートを、アルカリ性緩衝液で固定し、ブロッキング緩衝液中のヌクレオチド、核タンパク質と共にインキュベートする。 Follプレートを十分に洗浄するため、特異的一次抗体および二次抗体のインキュベーションは、比色反応の西洋ワサビペルオキシダーゼ基質及び現像を加えている。反応停止モードまたは連続的動力学的モニタリングを定量的DNAとタンパク質の相互作用を測定するために使用した。我々は、非特異的IgGとまたはタンパク質または一次抗体のない治療を含め、適切な特異性を制御し、議論する。アッセイのアプリケーションは、その薬剤スクリーニングにおける有用性と代表の正と負の結果が議論されているなど、記載されている。
Introduction
DNA結合アッセイは、DNAと相互作用する転写因子の能力を測定するのに有用である。 DNA結合のためのアッセイは、放射性標識オリゴヌクレオチドは、1または化学発光アッセイ2に依存する電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を含む。 96ウェルフォーマット4を用いたクロマチンimmuneprecipitation法（ChIP）に基づくアッセイ3ならびにアッセイも記載されている。しかしながら、EMSA、放射性標識オリゴヌクレオチドの使用を必要とする非定量的アッセイである。核タンパク質は、特定のヌクレオチドプロモーター配列と会合する場合、結合複合体は、ポリアクリルアミドゲル上で遅角であり、特定の転写因子は、抗体「スーパーシフト」で検証することができる。我々は定義されたプロモーター要素iに対応するDNA結合配列とRUNX2の相互作用を測定することができる酵素結合免疫吸着フォーマット（D-ELISA）を用いて定量的DNA結合アッセイを開発したn個のRUNX2標的遺伝子。抗RUNX2抗体の使用は、アッセイに特異性を提供し、放射性標識の不足は、伝統的なゲルシフトアッセイ5からこのアッセイを区別する。結合複合体の検出は、分光測光分析のための着色生成物へのHRP基質テトラメチルベンジジン（TMB）を変換する西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）に結合された二次抗体を用いて可能である。ここで報告アッセイは、対照として変異したDNAオリゴヌクレオチドの使用を組み込むことができ、DNA結合の競合的又は非競合的阻害剤の検出のために使用することができる。新規な抗腫瘍化合物のスクリーニングは、このアッセイでも可能である。
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA結合アッセイは、DNAと相互作用する転写因子の能力を測定するために使用される。 DNA結合のためのアッセイは、電気泳動移動度シフト（EMSA）1およびクロマチンimmuneprecipitation（チップ）に基づくアッセイ3だけでなく、このような化学発光アッセイ2として96ウェルフォーマット4を採用したアッセイが含まれる。 EMSAは、非定量的であり、放射性標識…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
メリーランド大学Greenebaumがんセンターのトランスレーショナル基盤施設、特に博士の技術支援および計測。レナLapidusはとMariola Sadowskaは、深く感謝している。このアッセイの開発を担当して作業がAHA費補助金GRNT2130014、APへのVA優秀賞、およびマレーネ·スチュワートに提供メリーランド大学のタバコ反発基金（CRF）により、NIH RO1CA108846によって部分的に資金を供給されたGreenebaumがんセンター。
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Poly dI/dC | GE Healthcare, Piscataway, NJ | US20539-5UN | 1 U ~50mg |
| RUNX2 antibody | MBL International Corp., Woburn, MA | D130-3 | 1 mg/ml |
| Fab-specific peroxidase conjugated antibody | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9917 | 7.1 mg/ml |
| TMB Substrate (tetramethyl benzidine) | EXALPHA Biologicals, Shirley, MA | X1189S | 100 ml |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 57995 | Plate-fixing |
| Sulfuric Acid | VWR, West Chester, PA | BDH-39922-1 | Stop solution |
| Multi-well plates | Greiner Bio-One, Basel, Switzerland | 655996 | Avidin-coated, black sides |
| HALT | Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL | 78440 | Protease and phosphatase inhibitors |
| Chemicals | Various manufacturers | Laboratory grade | |
| Table 1. Reagents | |||
| Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader | Amersham Biosciences | For use with stop reaction method | |
| Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader | Bio-Tek Instruments, Inc. | For use with continuous kinetic monitoring | |
| Table 2. Equipment |
References
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