Rekombinant Proteinlerin Yüksek-düzey Geçici İfade için Bitkiler Verimli Agroinfiltration
Summary
Bitkiler Geçerli ifade paradigmalar göre daha daha fazla, ölçeklenebilir bir maliyet-etkin ve emniyetli olan, bir ticari bir ölçekte ilgili sayısız farmasötik bir proteinlerin bölgesinin üretimi için bir Roman sistem mü tavsiye edeceksiniz. Bu çalışmada, biz içeren hedef-gen tanıtmak için bir basit ve kullanışlı, henüz ölçeklenebilir bir yaklaşım rapor<em> Agrobacterium tumefaciens'in</em> Protein geçici ekspresyonu için bitkiler içine.
Abstract
Memeli hücre kültürü İnsan aşısı ve terapötik proteinler bölgesinin ticari bir üretimi için gerekli ana bir platform olduğunu. Ancak, onun sınırlı ölçeklenebilirlik ve yüksek maliyet nedeniyle ilaç için artan dünya çapında talep karşılamak değildir. Bitkiler sağlam, ölçeklenebilir, düşük maliyetli ve güvenli olan en umut verici alternatif ilaç üretim platformlarından biri olduğu gösterilmiştir var. Virüs-temelli Vektörel Çizimler bölgesinin son gelişme bitkilerde otelinin yeniden birleştirici proteinlerin bölgesinin çabuk ve daha yüksek-düzey geçici ifade izin verdi biriktirdi. Daha da geçici ifade sisteminin yardımcı programı optimize etmek için, biz bu çalışmada bitki doku içine hedef-genini içeren Agrobacterium tanıtmak için bir, basit, verimli ve ölçeklenebilir metodoloji göstermek. GFP ve DsRed; Bizim sonuçlarımız yöntemleri yaprakları ve, iki floresan proteinleri bölgesinin sağlam bir üretim haline Agrobacterium'un bölgesinin etkin bir şekilde giriş sonuçlandı oylandı şırınga ve vakum her ikisi de ile bu agroinfiltration işaret etmektedir. Bundan başka,biz her iki yöntem tarafından sunulan benzersiz avantajlar göstermek. Şırınga infiltrasyon basittir ve pahalı ekipman gerekmez. Bu, aynı zamanda esneklik ya da tek bir hedef geni ile olmak üzere bütün bir izni içine süzülmek maksadıyla, ya da bir yaprak ilgili sayısız birden fazla hedeflere bölgesinin genleri tanıtmak için fiyatları karşılaştırın. Bu nedenle, bu yeniden birleştirici proteinlerin bölgesinin laboratuar ölçekli bir ekspresyonu için yanı sıra tekrarlamalı olarak verim ya da ifade kinetiği, için farklı proteinler ya da Vektörel Çizimler fiyatları karşılaştırırken için ikinci el edilebilir. Şırınga infiltrasyon sadeliği, aynı zamanda biyoteknoloji konusunu için lise ve üniversite eğitimi yılında kendi programını göstermektedir. Buna karşılık yılında, vakum infiltrasyonu ile daha sağlam bir olduğunu ve farmasötik bir proteinlerin bölgesinin ticari bir Üretim yılı için ölçekli-kadar olabilir. Ayrıca bu tür marul ve Arabidopsis olarak şırınga infiltrasyon için mükellef değildir bitki türleri agroinfiltrate mümkün olmanın avantajı sunuyor. Genel olarak değiştirin, şırıngayı ve vakum agroinfiltration bölgesinin bir kombinasyon araştırmacı ve eğitimci tarafından görüşler sağlar, bir, basit, verimli, ve sağlamgeçici protein ekspresyonu için metodoloji. Bu büyük ölçüde ilaç proteinlerin gelişimi kolaylaştırmak ve fen eğitimi teşvik edecektir.
Introduction
1970'lerden bu yana, bitkiler rekombinant proteinler ve protein tedavi 1 en ticari üretimi için, memeli böcek, ve bakteriyel hücre kültürleri alternatif olarak araştırılmıştır. Biyofarmasötik ifadesi için bitki-tabanlı sistemler klinik çalışmalarda başarı göstermiştir, Gaucher Hastalığı 2, ve kuş H5N1 gribi 3 gibi hastalıklar, için birkaç yeni tedaviler olarak son yıllarda söz göstermiştir. Bu ilk deneyleri yılından bu yana on yıllarda bitkilerde rekombinant protein ekspresyonu için yetkili mekanizmaların gelişimi üç ana nedenden dolayı protein Mevcut üretim paradigma değiştirmek için bitki-tabanlı sistemler için potansiyel yarattı. İlk olarak,, memeli böcek, ve bakteriyel biyoreaktörler hatırı sayılır başlangıç maliyetleri, pahalı büyüme ortamı, ve aşağı akım saflaştırma 4 için karmaşık süreçler gerektiren olarak maliyet yılında kayda değer bir azalma var. Istikrarlı bir transgenik bir bitki bölgesinin yaratılması,hatları da protein ifade bitkilerin yetiştirildiği ve bir tarım ölçeği 5 üzerinde hasat olabilir gibi onları diğer ifade sistemlerinin ölçeklenebilirlik geride için izin verir. İkinci olarak, bitki-tabanlı ifade sistemleri önemli ölçüde kamu güvenliği 6 içinde üstünlüğünü gösteren, insanlara protein-ifade ana bilgisayardan bir insan veya hayvan patojen verici riskini azaltmak. Son olarak, bitkiler glikosilasyon ve birden çok-alt-birimi proteinlerin 7 bölgesinin derleme dahil olmak üzere proteinleri bölgesinin düzgün bir yazılan Mesajı göster-translasyonel modifikasyonu için izin veren, memeli hücreleri için 'e benzer olduğunu, bir ökariyotik endomembran sistemi kullanmaktadır. Bu yetenek bir daha karmaşık yapıya sahip ve kapsamlı posttranslasyonel değişiklikler veya montaj 8 gerektiren, monoklonal antikorlar (mAbs) de dahil olmak üzere ilaç rekombinant proteinlerin daha geniş bir dizi, yılından bu yana, bakteriler gibi prokaryotik sistemleri, dayalı olanlar öncesinde bitki-tabanlı sistemler koyar.
Iki büyük beğenme vardır Birbitkiler otelinin yeniden birleştirici proteinler ifade eden bulundunuz aşkınla kanıyor. Olanlar önce Herhangi, hedef ilgili protein için kodlama DNA'nın bir ifade kaset içine klonlandı ve nükleer ya da kloroplast, genomların Her iki durumda da için tanıtıldı, bir stabil bir şekilde transgenik hattı ile, bölgesinin bir gelişmedir. Bunu yaparken, yabancı DNA nesiller başarılı yoluyla kalıtsal hale gelir ve kadar diğer ekspresyon sistemleri 1 özelliğinin ötesinde bir, muazzam geliştirilmiş ölçeklenebilirlik için izin verir. Nükleer genom için bunlara dışarıdan ayrıca DNA sokulması; Ortalama gönderim süresi doku, 9 takım arasından mikroprojektil bombardımanı edenler tarafından, daha az sıklıkta,, bir bitki dokusu bölgesinin Agrobacterium tumefaciens'in enfeksiyon edenler tarafından gerçekleştirildiğini ya da edilir. Bitki hormonları O zamanki farklılaşma ve kökleri ve yaprakları gibi bu tür transgenik bir bitki dokusunun bölgesinin büyümesini teşvik etmek için ikinci el uygulanır. Olan kloroplastın genom bölgesinin dönüştürülmesi A ile birlikte elde edilebilir değil, olabilir DNA ile kaplanmış tumefaciens ', fakat altın veya tungsten partikülleri, ilgili sayısız tamamen güvenir bitki hücrelerine yerleştirmek için balistik olarak ateş etti. Recombina ifade İkinci yöntembitkiler otelinin nt protein geçici ifade aracılığıyla 10 olduğunu. Bu senaryoda yılında, faiz bölgesinin edilen geni taşıyan virüs-Türetilmiş bir Vektörel Çizimler A. cihaz aracılığıyla teslim edilir bir süreç yoluyla tam gelişmiş bitkiler için tumefaciens agroinfiltration çağırdı. Bunun yerine, bitki genomuna içine entegre bölgesinin idarelerce, teslim alınan gen yapısı, O zamanki, kısa bir kuluçka bir süre sonra hasat edildi ve izole edilebilir verebiliriz, böylelikle istenilen proteinin, bölgesinin geçici doğrudan üretimde bulunmak bulundunuz başlayacak doyurmaya. Bitkiler agroinfiltration 11 sonra yaklaşık 1-2 hafta hasat için hazır olacak gibi geçici gen ekspresyonu, daha büyük bir genel protein birikimi yanı sıra protein üretim geliştirilmiş bir zaman avantajı sunuyor. Bu, bir yıl için birkaç ay sürebilir istikrarlı transgenik bitki hatları, nesil, seçimi, ve onay süreçleri daha önemli ölçüde daha hızlı olduğunu. Bu genetik olarak istikrarlı bitki li verim olmayacak gibi Ancak bu,, aynı zamanda geçici ifade sisteminin sınırlamasıdırbüyük bir ölçekli ticari üretim için bir tohum bankası oluşturmak için de kullanılabilir olabilir Nes. Bu rağmen, yaklaşımları büyük ölçekli bir geçici ifade iyileştirmek için geliştirilmiştir oylandı oylandı. Burada, biz A. edenler tarafından teslim edilen yapıbozuma viral bir Vektörel Çizimler kullanarak geçici bir proteini-ifade eden Nicotiana benthamiana bitkilerin bölgesinin nesil bölgesinin biri yöntem ortaya koymaktadır tumefaciens.
İki büyük Yöntemleri A. bölgesinin Sevkiyat için geliştirilen ediliyor edilmektedir bitki doku içine tumefaciens: vakum odası aracılığı ile şırınga ve büyük ölçekli infiltrasyon aracılığı ile tezgah ölçek infiltrasyonu. Her iki protokol N. kullanıyorsanız burada açıklanmıştır yakından ortak tütün bitki ile ilgilidir benthamiana,, iki floresan proteinleri geçici ifadesi için ev sahibi bitki olarak: denizanası Aequorea victoria ve Discosoma mercan (DsRed) 12,13 gelen kırmızı floresan proteini gelen yeşil floresan proteini (GFP). N. benthamiana için var En sık görülen ev sahibi bitki olduğunubu genetik transformasyon için uygun, çünkü rekombinant protein, hızlı bir şekilde biyokütle yüksek miktarda verim, ve ölçek-up üretim 14 için bir üretken tohum üreticisidir olabilir. N kullanarak bölgesinin bir diğer gibi olanaklar protein ekspresyonu için hosts olarak benthamiana ekspresyon Vektörel Çizimler 2,5 bölgesinin, bir ve çeşitli bölgesinin Rezervasyon durumuna olduğunu. Bu çalışmada, yılında, iki yapıbozuma viral bir Vektörel Çizimler de, bir tütün mozaik virüsü (TMV) RNA dır replikon da içerebilir sistemi (MagnICON Vektörel Çizimler) ve fasulye sarı, cüce bir virüsü (BeYDV), DNA replikon da içerebilir sistemi (geminiviral Vektörel Çizimler) 4,11 adlı işletmeye türeyen diğer, ilgili sayısız dayalı bir 15-18, GFP ve DsRed gen taşımak ve N. içine onları teslim etmek için kullanılan edilir A. yoluyla benthamiana hücreleri tumefaciens '. Üç DNA yapıları GFP ile veya MagnICON Vektörel Çizimler ile birlikte DsRed ekspresyon için ikinci el uygulanmaz doyurmaya. Onlar İlgi bölgesinin ait geni ihtiva eden modülü (PiCh 5 en ', hedef gen, normal gene 3 bölgesinin ifade sürüş için en promotör ve diğer genetik elementler içeren modülü (pICH15879)' include-GFP veya PiCh-DsRed) eklenmiş ve, integraz modülü (pICH14011) ifade 8,15 üzerine doğrudan 5 've 3' modüllerin birlikte başarılı çalışmalarını entegre eden bir enzim için kodlama tekniklerinin anlaşılması. Üç DNA yapıları, aynı zamanda geminiviral Vektörel Çizimler ile ilgili yeni biçimler için ihtiyaç vardır. , Hedef genin (pBYGFP ya da pBYDsRed) bölgesinin replikon da içerebilir ihtiva eden Vektörel Çizimler bulundunuz Buna ek olarak yani, çoğaltma proteini (pREP110) Şunun için kodlama yapan bir Vektörel çizim, hedef replikon da içerebilir 11,14,16 bölgesinin amplifikasyonu için gereklidir. Bundan başka, domates bushy stunt virus adlı işletmeye susturma bastırıcı syf 19 kodlayan bir Vektörel çizim bölgesinin eklenmesi yüksek seviyesi hedef gen ekspresyonu 11,16 için arzu edilir.
Bitki büyüme, A. de dahil olmak üzere agroinfiltration edenler tarafından bitki hücrelerine yerleştirmek için yeniden birleştirici proteinlerin bölgesinin genlerin bölgesinin tanıtımı yılı için üç büyük adımlar genel olarak, vardır Bir tumefaciens kültür hazırlanması, ve infiltrasyon. Her biri için her adımda Bu yordamı bölgesinin nihai başarısı için kritik öneme sahiptir gibi, bu nedenle, ayrıntılı bir açıklama verilmedi edilmektedirşırınga infiltrasyon ve aşağıda vakum infiltrasyon her ikisi için de.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protein bazlı ilaç için artan talepleri tüm dünyada sağlam, ölçeklenebilir, düşük maliyetli ve güvenli yeni üretim platformları gerektirir. Bitkiler ilaç protein üretimi için en umut verici alternatif üretim sistemlerinden biri olarak göstermiştir. Son yıllarda, yıkılıp virüs esaslı vektörler geliştirilmesine büyük ölçüde hız ve bitki ekspresyon sistemleri 2,10 verimi artırır bitkilerdeki protein, geçici ifade sağladı. Daha da geçici ifade sisteminin programı optimize …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz R. Güneş ve katkılarından dolayı Chen'in Laboratuvarı diğer öğrencilere malzeme üretimi bitki teşekkür ederim. Ayrıca Teknoloji ve Yenilik (CTI) ve College lisans araştırma verdiği destek için Dr D. Yeşil teşekkür ederim. Bu araştırma S. Chen NIH hibe U01 AI075549 ve 1R21AI101329 ve S. Chen için Arizona Devlet Üniversitesi CTI bir SSE hibe ile kısmen desteklenmiştir. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado, ve J. Stahnke SSE hibe ile desteklenen lisans öğrencileridir.
Materials
| Reagents | |||
| GFP | Invitrogen | V353-20 | www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008 |
| DsRed | Clontech | 632152 | www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000 |
| MagnICON Vector | Icon Genetics | n/a | www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006 |
| Geminiviral Vector | Author’s Lab | n/a | See reference: Chen and He, et al 2011 |
| N. benthamiana | Author’s Lab | n/a | herbalistics.com.au |
| Agrobacterium tumefaciens strain gv3101 | Author’s Lab | n/a | See reference: Lai and Chen 2012 |
| LB Agar Carbenicillin-100, plates | Sigma | L0418 | www.sigmaaldrich.com |
| LB Agar Kanamycin-50, plates | Sigma | L0543 | www.sigmaaldrich.com |
| Magnesium sulfate hepa hydrate | Sigma | M2773-500 g | www.sigmaaldrich.com |
| Bacto-Tryptone | Fisher | 73049-73-7 | www.fishersci.com |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dickinson & CO. | REF 212750 | www.bd.com |
| Difco Nutrient Broth | Becton, Dickinson & CO. | REF 234000 | www.bd.com |
| MES hydrate Buffer | Sigma | M8250-1kg | www.sigmaaldrich.com |
| Carbenicillin | Sigma | C1613-1ML | www.sigmaaldrich.com |
| Kanamycin | Sigma | 70560-51-9 | www.sigmaaldrich.com |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 221465 | www.sigmaaldrich.com |
| Jack’s Fertilizer | Hummert International | Jul-25 | www.hummert.com |
| Equipment | |||
| Vacuubrand MD4 Vacuum Pump | Fisher | 13-878-113 | www.fishersci.com |
| Vacuum Air Regulator Valve | Fisher | NC9386590 | www.fishersci.com |
| Desiccator 12 1/8″ with O ring | Fisher | 08-594-15C | www.fishersci.com |
| 3 L Tub | Rubber-Maid | n/a | Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work |
| plate/shelf 230ML | Fisher | NC9489269 | www.fishersci.com |
| Peat Pellet | Hummert International | 14-2370-1 | www.hummert.com |
| Propagation Tray Dome | hydrofarm | 132052 | www.hydroponics.net |
| Propagaiton Tray | hydrofarm | 138758 | www.hydroponics.net |
| Virbo Hand Seeder | Gro-Mor INC | n/a | www.gro-morent.com |
| Flora Cart 4 shelf | Hummert International | 65-6924-1 | www.hummert.com |
| 15 ml Round Bottom Culture Tubes | Sigma | CLS430172-500EA | http://www.sigmaaldrich.com |
| Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | www.bio-rad.com |
| Spectrophotometer Cuvettes | Bio-Rad | 223-9950 | www.bio-rad.com |
| Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | www.usascientific.com |
| Benchtop Centrifuge | Bio-Rad | 166-0602EDU | www.bio-rad.com |
| Incubator/Shaker | Eppendorf | Excella E25 | www.eppendorf.com |
| Ultraviolet Light Model#: UVGL-25 | UVP | 95-0021-12 | www.uvp.com |
References
- Chen, Q., Mou, B., Scorza, R. . Transgenic Horticultural Crops: Challenges and Opportunities – Essays by Experts. , 86-126 (2011).
- Chen, Q., Lai, H. Plant-derived virus-like particles as vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9, 26-49 (2013).
- Landry, N., et al. Preclinical and clinical development of plant-made virus-like particle vaccine against avian H5N1 influenza. PLoS One. 5, e15559 (2010).
- Lai, H., Chen, Q. Bioprocessing of plant-derived virus-like particles of Norwalk virus capsid protein under current Good Manufacture Practice regulations. Plant Cell Reports. 31, 573-584 (2012).
- Chen, Q. Expression and Purification of Pharmaceutical Proteins in Plants. Biological Engineering. 1, 291-321 (2008).
- Chen, Q. Turning a new leaf. European Biopharm. Rev. 2, 64-68 (2011).
- Chen, Q., Levine, M. M., et al. . New Generation Vaccines. , 306-315 (2009).
- Lai, H., et al. Monoclonal antibody produced in plants efficiently treats West Nile virus infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2419-2424 (2010).
- Buswell, S., Medina-Bolivar, F., Chen, Q., Van Cott, K., Zhang, C. Expression of porcine prorelaxin in transgenic tobacco. Annals of the New York Academy of Sciences. 1041, 77-81 (2005).
- Lico, C., Chen, Q., Santi, L. Viral vectors for production of recombinant proteins in plants. J. Cell. Physiol. 216, 366-377 (2008).
- Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Hum. Vaccin. 7, 331-338 (2011).
- Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97, 11984-11989 (2000).
- Lai, H., He, J., Engle, M., Diamond, M. S., Chen, Q. Robust production of virus-like particles and monoclonal antibodies with geminiviral replicon vectors in lettuce. Plant Biotechnology Journal. 10, 95-104 (2012).
- Giritch, A., et al. Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14701-14706 (2006).
- Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714 (2009).
- Santi, L., et al. An efficient plant viral expression system generating orally immunogenic Norwalk virus-like particles. Vaccine. 26, 1846-1854 (2008).
- He, J., Lai, H., Brock, C., Chen, Q. A Novel System for Rapid and Cost-Effective Production of Detection and Diagnostic Reagents of West Nile Virus in Plants. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 1-10 (2012).
- Huang, Z., et al. High-level rapid production of full-size monoclonal antibodies in plants by a single-vector DNA replicon system. Biotechnol. Bioeng. 106, 9-17 (2010).
- Kuta, D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4, 752-757 (2005).
- Phoolcharoen, W., et al. Expression of an immunogenic Ebola immune complex in Nicotiana benthamiana. Plant Biotechnology Journal. 9, 807-816 (2011).
- Phoolcharoen, W., et al. A nonreplicating subunit vaccine protects mice against lethal Ebola virus challenge. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 20695-20700 (2011).
- Herbst-Kralovetz, M., Mason, H. S., Chen, Q. Norwalk virus-like particles as vaccines. Expert Rev. Vaccines. 9, 299-307 (2010).
- Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Adv. Tech. Biol. Med. 1, 103 (2013).
