Flowcytometrische analyse van Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie: Een High Throughput kwantitatieve methode om eiwit-eiwit interactie Studie
Summary
Flowcytometrische analyse van Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie biedt een hoge doorvoer kwantitatieve methode om eiwit-eiwit interacties te bestuderen. Deze methodologie kan worden toegepast op mapping eiwitbindingsplaatsen en screenen factoren die eiwit-eiwit interactie te bepalen.
Abstract
Onder methodes om eiwit-eiwit interacties binnen cellen te bestuderen, Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) is relatief eenvoudig en gevoelig. BiFC is gebaseerd op de productie van fluorescentie met behulp van twee niet fluorescerende fragmenten van een fluorescent eiwit (Venus, een geel fluorescent eiwit variant wordt hier gebruikt). Niet-fluorescerende Venus fragmenten (VN en VC) gefuseerd aan twee interagerende proteïnen (in casu AKAP LBC-en PDE4D3), waardoor fluorescentie door VN-AKAP-LBC-VC-PDE4D3 interactie en de vorming van een functioneel fluorescent eiwit in cellen.
BiFC geeft informatie over de subcellulaire lokalisatie van eiwitcomplexen en de kracht van eiwit interacties op basis van fluorescentie-intensiteit. Echter, BiFC microscopische analyse van de sterkte van eiwit-eiwit interacties te kwantificeren is tijdrovend en enigszins subjectief door heterogeniteit in eiwitexpressie en interactie. Door koppeling flowcytometrischeanalyse BiFC methodologie, kan het fluorescerende BiFC eiwit-eiwitinteractie signaal nauwkeurig worden bepaald voor een grote hoeveelheid cellen in een korte tijd. Hier tonen we een toepassing van deze methode in kaart regio's in PDE4D3 die nodig zijn voor de interactie met AKAP-LBC. Deze high throughput methode kan worden toegepast op screening factoren die eiwit-eiwit interactie te bepalen.
Introduction
650,000 eiwit-eiwit interacties worden geraamd, dat in het menselijk interactome, spelen cruciale rol in het handhaven van normale celfuncties 1,2. Naast co-immunoprecipitatie (co-IP), de gouden standaard eiwit-eiwit interacties te bestuderen van cellysaat, verschillende eiwitbanden fragment complementatie bepalingen (PCA) zijn ontwikkeld om de gevoeligheid in het detecteren van eiwit-eiwit interacties binnen cellen 3 verbeteren. Technieken omvatten Förster-energieoverdracht (FRET), Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET), en Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) 4,5. BiFC is gebaseerd op het vergemakkelijkt associatie van twee fragmenten van een fluorescerend eiwit (hier gebruiken we Venus, een YFP variant) die elk worden gefuseerd aan een potentiële interactie eiwit partner (in dit voorbeeld gebruiken we AKAP LBC-en PDE4D3). Interactie van de twee eiwitten van belang in cellen resulteert in functionele fluorescentie, die gevisualiseerd door f kanluorescence microscopie met behulp van live of vaste cellen 6,7,8. Vergeleken met andere PCA's, BiFC is gevoelig en minder technisch uitdagend, met potentieel om de cellulaire lokalisatie in levende cellen te bestuderen. Een belangrijk nadeel van deze techniek is echter dat eenmaal gevormd, het fluorescerende eiwit complex kan niet worden omgekeerd. Daarom is het niet een goede methode om dynamische eiwit-eiwit interacties te bestuderen. In dit artikel gebruiken we BiFC om de interactie plaatsen van PDE4D3 kaart met AKAP-LBC door monitoring van de fluorescentie-intensiteiten van Venus. Vergeleken met traditionele analyse met fluorescentie microscopie, hetgeen tijdrovend en arbeidsintensief (indien niet uitgevoerd met behulp van geautomatiseerde high throughput machines), flowcytometrie biedt een eenvoudige kwantitatieve analyse van duizenden cellen in een heterogene populatie over een korte tijd 9, 10. Hier, door het uitvoeren van een side-by-side vergelijking van flowcytometrische analyse-BiFC en traditionele co-IP, tonen we aan dat de twee methoden bieden vergelijkbare gegevens echter flowcytometrische BiFC analyse is minder tijdrovend en gebruikt minder materiaal dat nuttiger kunnen zijn wanneer de cellen van belang zijn beperkt.
Protocol
Representative Results
Discussion
BiFC is een eenvoudige en gevoelige methode om eiwit-eiwit interacties te bestuderen. Deze werkwijze kan niet worden gebruikt om nieuwe eiwit-eiwit interacties te identificeren, maar het is vooral handig om eiwit-eiwit interacties binnen cellen bevestigen en functionele eigenschappen te bestuderen, zoals subcellulaire lokalisatie van eiwitcomplexen, in kaart brengen van eiwit-eiwit interactieplaatsen en voor het screenen van kleine moleculen / peptiden die eiwit-eiwit interacties kunnen moduleren. Omdat VN en VC fragmen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de O'Bryan lab bij UIC voor kritische experimentele evaluatie en discussie. Dit werk werd ondersteund door de American Heart Association Grant 11SDG5230003 om GKC en National Center for Translational Science Vooruitgaan – UIC Centrum voor klinisch en translationeel Sciences Grant UL1TR000050.
Materials
| REAGENTS | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x | Invitrogen | 15070-063 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 16000-044 | |
| Anti-Flag antibody | Sigma | M2, F1804 | |
| Anti-HA antibody | Covance | 16B12, MMS-101R | |
| α-tubulin | Sigma | DM1A, T9026 | |
| Anti-GFP antibody | Clontech | 632569 | |
| Cell culture plates, 6-well tissue culture treated | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Maxiprep plasmid purification kit, high speed | Qiagen | 12663 | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x | Invitrogen | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Gibco | 25300 | |
| Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Biosciences | 352052 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | S74337MF | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Superfrost plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Fisherfinest premium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| EQUIPMENT | |||
| CO2 air-jacketed Incubator | NuAIR DH autoflow | ||
| Confocal microscope LSM510 META | Carl Zeiss, Inc | ||
| Electrophoresis and transfer unit | Biorad | ||
| Cyan ADP Flow Cytometer | Beckman Coulter |
References
- Collura, V., Boissy, G. From protein-protein complexes to interactomics. Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).
- Stumpf, M. P., et al. Estimating the size of the human interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).
- Shekhawat, S. S., Ghosh, I. Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).
- Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).
- Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).
- Wong, K. A., O’Bryan, J. P. Bimolecular fluorescence complementation. J. Vis. Exp. (50), e2643 (2011).
- Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology. Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).
- Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry. J. Vis. Exp. (45), e2429 (2010).
- Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14 (Unit 14), 11 (2008).
- Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis. Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).
- Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation. Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).
