Bimolecular प्रतिदीप्ति complementation का प्रवाह cytometric विश्लेषण: प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक उच्च Throughput मात्रात्मक विधि
Summary
Bimolecular प्रतिदीप्ति complementation का प्रवाह cytometric विश्लेषण प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक उच्च throughput मात्रात्मक तरीका प्रदान करता है. इस पद्धति मानचित्रण प्रोटीन बाध्यकारी साइटों के लिए और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत नियंत्रित करने वाले कारकों स्क्रीनिंग के लिए लागू किया जा सकता है.
Abstract
कोशिकाओं के अंदर प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के तरीकों के अलावा, Bimolecular प्रतिदीप्ति complementation (BiFC) अपेक्षाकृत सरल और संवेदनशील है. BiFC एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के दो गैर फ्लोरोसेंट टुकड़े (वीनस, एक पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन संस्करण, यहाँ प्रयोग किया जाता है) का उपयोग कर प्रतिदीप्ति के उत्पादन पर आधारित है. गैर फ्लोरोसेंट वीनस टुकड़े (वी.एन. और कुलपति) के कारण वी.एन.-AKAP-एलबीसी-उपकुलपति PDE4D3 बातचीत और एक कार्यात्मक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के गठन के लिए प्रतिदीप्ति उपज, दो बातचीत प्रोटीन (इस मामले में, AKAP-एलबीसी और PDE4D3) से जुड़े हुए हैं कोशिकाओं के अंदर.
BiFC प्रोटीन परिसरों के subcellular स्थानीयकरण और प्रतिदीप्ति तीव्रता के आधार पर प्रोटीन बातचीत की शक्ति के बारे में जानकारी प्रदान करता है. हालांकि, प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की शक्ति यों के लिए माइक्रोस्कोपी का उपयोग BiFC विश्लेषण समय लेने वाली और प्रोटीन अभिव्यक्ति और बातचीत में विविधता के कारण कुछ हद तक व्यक्तिपरक है. Cytometric प्रवाह युग्मनBiFC पद्धति के साथ विश्लेषण, फ्लोरोसेंट BiFC प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के संकेत सही एक कम समय में कोशिकाओं की एक बड़ी मात्रा के लिए मापा जा सकता है. यहाँ, हम AKAP-एलबीसी के साथ बातचीत के लिए आवश्यक हैं कि PDE4D3 में क्षेत्रों नक्शा करने के लिए इस पद्धति की एक आवेदन प्रदर्शन. यह उच्च throughput कार्यप्रणाली प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत विनियमित कि स्क्रीनिंग कारकों के लिए लागू किया जा सकता है.
Introduction
650,000 प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत सामान्य कोशिका कार्यों 1,2 को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है, मानव interactome में मौजूद होने का अनुमान है. सह immunoprecipitation इसके अलावा (सह आईपी), सोने के मानक (पीसीए) 3 कोशिकाओं के अंदर प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने में संवेदनशीलता में सुधार करने के लिए विकसित किया गया है, सेल lysate से कई प्रोटीन टुकड़ा पूरक assays के प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए. तकनीक Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट), bioluminescence प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (ब्रेट), और Bimolecular प्रतिदीप्ति complementation (BiFC) 4,5 शामिल हैं. हर एक संभावित बातचीत प्रोटीन साथी (इस उदाहरण में हम AKAP-एलबीसी और PDE4D3 उपयोग) के लिए जुड़े हुए हैं कि, BiFC एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के दो टुकड़े (एक YFP संस्करण यहाँ हम वीनस का उपयोग करें) की मदद की सहयोग पर आधारित है. च से देखे जा सकते हैं जो कार्यात्मक प्रतिदीप्ति में कोशिकाओं के परिणाम के अंदर ब्याज की दो प्रोटीन की बातचीतरहते हैं या तय कोशिकाओं 6,7,8 या तो उपयोग कर luorescence माइक्रोस्कोपी. अन्य PCAs की तुलना में, BiFC जीवित कोशिकाओं में सेलुलर स्थानीयकरण का अध्ययन करने की क्षमता के साथ, संवेदनशील और कम तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है. इस तकनीक का एक प्रमुख दोष यह है कि हालांकि एक बार का गठन, फ्लोरोसेंट प्रोटीन जटिल उलट नहीं किया जा सकता है. इसलिए यह गतिशील प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा तरीका नहीं है. इस पत्र में, हम वीनस की प्रतिदीप्ति तीव्रता निगरानी द्वारा AKAP-एलबीसी के साथ PDE4D3 की बातचीत साइटों नक्शा करने BiFC का उपयोग करें. (स्वचालित उच्च throughput मशीनरी का उपयोग किया जाता है, अगर नहीं) समय लेने वाली और श्रम प्रधान है जो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर परंपरागत विश्लेषण की तुलना में, प्रवाह cytometry, एक कम समय 9 से अधिक एक विषम जनसंख्या में कोशिकाओं के हजारों की एक सरल मात्रात्मक विश्लेषण प्रदान करता है 10. इधर, प्रवाह cytometric-BiFC विश्लेषण और सह आईपी पारंपरिक का एक पक्ष द्वारा साइड तुलना बाहर ले जाने से, हमें पता चलता है कि दो मीटरethods तुलनीय डेटा प्रदान करते हैं, तथापि, प्रवाह cytometric BiFC विश्लेषण में काफ़ी समय कम है और ब्याज की कोशिकाओं को सीमित कर रहे हैं जब अधिक उपयोगी हो सकता है जो कम सामग्री का उपयोग करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
BiFC प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक सरल और संवेदनशील तरीका है. इस विधि नए प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की पहचान करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है, तथापि, यह कोशिकाओं के अंदर प्रोटीन, प्र…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम महत्वपूर्ण प्रायोगिक मूल्यांकन और चर्चा के लिए यूआईसी पर O'Bryan प्रयोगशाला धन्यवाद. नैदानिक और translational विज्ञान अनुदान UL1TR000050 के लिए यूआईसी केंद्र – इस काम translational विज्ञान में आगे बढ़ने के लिए GKC और राष्ट्रीय केन्द्र के लिए अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन अनुदान 11SDG5230003 द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| REAGENTS | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x | Invitrogen | 15070-063 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 16000-044 | |
| Anti-Flag antibody | Sigma | M2, F1804 | |
| Anti-HA antibody | Covance | 16B12, MMS-101R | |
| α-tubulin | Sigma | DM1A, T9026 | |
| Anti-GFP antibody | Clontech | 632569 | |
| Cell culture plates, 6-well tissue culture treated | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Maxiprep plasmid purification kit, high speed | Qiagen | 12663 | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x | Invitrogen | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Gibco | 25300 | |
| Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Biosciences | 352052 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | S74337MF | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Superfrost plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Fisherfinest premium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| EQUIPMENT | |||
| CO2 air-jacketed Incubator | NuAIR DH autoflow | ||
| Confocal microscope LSM510 META | Carl Zeiss, Inc | ||
| Electrophoresis and transfer unit | Biorad | ||
| Cyan ADP Flow Cytometer | Beckman Coulter |
References
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