Flowcytometrisk analyse av bimolecular Fluorescens complementation: En høy gjennomstrømning Kvantitativ metode for å studere protein-protein interaksjon
Summary
Flowcytometrisk analyse av bimolecular Fluorescens complementation gir en høy gjennomstrømming kvantitativ metode for å studere protein-protein interaksjon. Denne metoden kan brukes til kartlegging proteinbindingsseter og for screening av faktorer som regulerer protein-protein interaksjon.
Abstract
Blant metoder for å studere protein-protein interaksjon inne i celler, er bimolecular fluorescens complementation (BiFC) relativt enkel og følsom. BiFC er basert på produksjon av fluorescens ved hjelp av to ikke-fluorescerende fragmenter av et fluorescerende protein (Venus, en gul fluorescerende protein variant, blir brukt her). Non-fluorescerende Venus fragmenter (VN og VC) er smeltet til to interagerende proteiner (i dette tilfellet, AKAP-Lbc og PDE4D3), gir fluorescens grunn VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 samhandling og dannelse av et funksjonelt fluorescerende protein inni cellene.
BiFC gir informasjon om subcellular lokalisering av protein komplekser og styrken av protein interaksjoner basert på fluorescens intensitet. Imidlertid er BiFC analyse ved hjelp av mikroskopi for å kvantifisere styrken av protein-protein interaksjonen tidkrevende og noe subjektivt på grunn av heterogeniteten i proteinekspresjon og interaksjon. Ved kopling flowcytometriskanalyse med BiFC metodikk, kan den fluorescerende BiFC protein-protein interaksjon signal måles nøyaktig for et stort antall av celler i en kort tid. Her viser vi en anvendelse av denne metodikken for å kartlegge områder i PDE4D3 som er nødvendige for samhandling med AKAP-Lbc. Denne høye gjennomstrømning metodikk kan anvendes til screening av faktorer som regulerer protein-protein interaksjon.
Introduction
650.000 protein-protein interaksjoner er anslått til å eksistere i den menneskelige interactome, spiller viktige roller i å opprettholde normal celle funksjoner 1,2. Foruten co-immunoutfelling (co-IP), for å studere den gull-standarden protein-protein interaksjon fra cellelysat, flere proteinfragment komplementering assays (PCA) er blitt utviklet for å forbedre følsomheten i å oppdage protein-protein interaksjon inne i celler 3. Teknikker inkluderer Förster resonans energi overføring (FRET), Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET), og bimolecular Fluorescens complementation (BiFC) 4,5. BiFC er basert på den forenklede sammenslutning av to fragmenter av et fluorescerende protein (her bruke Venus, en YFP variant) som hver er kondensert til en potensiell interagerende protein partner (i dette eksempelet bruker vi AKAP-Lbc og PDE4D3). Interaksjon av de to proteiner av interesse inne i celler resulterer i funksjonell fluorescens, som kan visualiseres ved fluorescence mikroskopi ved hjelp av enten levende eller faste celler 6,7,8. Sammenlignet med andre PCAS, er BiFC sensitiv og mindre teknisk krevende, med potensial til å studere cellulær lokalisering i levende celler. En stor ulempe med denne teknikken er imidlertid at en gang dannet, kan den fluorescerende protein kompleks ikke reverseres. Derfor er det ikke er en god metode for å studere dynamisk protein-protein interaksjon. I denne artikkelen bruker vi BiFC å kartlegge samspillet områder av PDE4D3 med AKAP-Lbc ved å overvåke fluorescensintensiteter av Venus. Sammenlignet med tradisjonelle analyse ved hjelp av fluorescens-mikroskopi, som er tidkrevende og arbeidskrevende (hvis ikke utført ved hjelp av automatisert maskineri høy gjennomstrømning), gir strømningscytometri en grei kvantitativ analyse av tusener av celler i en heterogen populasjon over en kort tid 9, 10. Her, ved å utføre en side-ved-side-sammenligning av flowcytometrisk analyse-BiFC og tradisjonelle co-IP, viser vi at de to methods gi sammenlignbare data, er imidlertid flowcytometrisk analyse BiFC mindre tidkrevende og krever mindre materiale som kan være mer nyttig når celler av interesse er begrenset.
Protocol
Representative Results
Discussion
BiFC er en enkel og følsom metode for å undersøke protein-protein interaksjon. Denne metode kan ikke brukes for å identifisere nye protein-protein interaksjoner, er det imidlertid særlig hensiktsmessig å bekrefte protein-protein interaksjon inne i celler og for å studere funksjonelle egenskaper, slik som subcellulære lokalisering av proteinkomplekser, kartlegging av protein-protein interaksjon steder, og for screening av små molekyler / peptider som kan modulere protein-protein interaksjon. Fordi VN og VC-fragm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker O'Bryan lab ved UIC for kritisk eksperimentell evaluering og diskusjon. Dette arbeidet ble støttet av American Heart Association Grant 11SDG5230003 til GKC og National Center for å fremme translasjonell Science – UIC Senter for klinisk og translasjonell Sciences Grant UL1TR000050.
Materials
| REAGENTS | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x | Invitrogen | 15070-063 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 16000-044 | |
| Anti-Flag antibody | Sigma | M2, F1804 | |
| Anti-HA antibody | Covance | 16B12, MMS-101R | |
| α-tubulin | Sigma | DM1A, T9026 | |
| Anti-GFP antibody | Clontech | 632569 | |
| Cell culture plates, 6-well tissue culture treated | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Maxiprep plasmid purification kit, high speed | Qiagen | 12663 | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x | Invitrogen | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Gibco | 25300 | |
| Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Biosciences | 352052 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | S74337MF | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Superfrost plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Fisherfinest premium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| EQUIPMENT | |||
| CO2 air-jacketed Incubator | NuAIR DH autoflow | ||
| Confocal microscope LSM510 META | Carl Zeiss, Inc | ||
| Electrophoresis and transfer unit | Biorad | ||
| Cyan ADP Flow Cytometer | Beckman Coulter |
References
- Collura, V., Boissy, G. From protein-protein complexes to interactomics. Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).
- Stumpf, M. P., et al. Estimating the size of the human interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).
- Shekhawat, S. S., Ghosh, I. Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).
- Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).
- Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).
- Wong, K. A., O’Bryan, J. P. Bimolecular fluorescence complementation. J. Vis. Exp. (50), e2643 (2011).
- Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology. Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).
- Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry. J. Vis. Exp. (45), e2429 (2010).
- Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14 (Unit 14), 11 (2008).
- Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis. Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).
- Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation. Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).
