אנו מתארים את השימוש של צבעי FM styryl למחזור שלפוחית הסינפטית תמונה בקצוות עצבים תפקודיים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם לא רק לעורר, אלא גם ספונטני ופעילות הסינפטית מיניאטורי. הפרוטוקול מרחיב את מגוון אירועים הסינפטי שניתן להעריך בצורה יעילה.
שלפוחית סינפטית בקצוות עצבים תפקודיים עוברת exocytosis ואנדוציטוזה. מחזור שלפוחית הסינפטית זה יכול להיות יעיל ניתח באמצעות צבעי FM styryl, אשר חושפים את המחזור בממברנה. פרוטוקולים מקובלים לשימוש בצבעי FM נועדו לניתוח נוירונים הבאים פעילות הסינפטית מגורה (עורר). לאחרונה, פרוטוקולים הפכו זמינים לניתוח אותות FM המלווים את פעילות הסינפטית חלשה יותר, כגון אירועים הסינפטי ספונטניים או מיניאטורי. ניתוח של שינויים הקטנים אלה באותות FM דורש כי מערכת ההדמיה היא רגישה מספיק כדי לזהות שינויים קטנים בעוצמתם, אך כי שינויי artifactual של משרעת גדולה מודחקים. כאן אנו מתארים פרוטוקול שניתן להחיל על עורר, ספונטני, ופעילות הסינפטית מיניאטורי, ולהשתמש בנוירונים בהיפוקמפוס בתרבית לדוגמה ירושלים. פרוטוקול זה משלב גם אמצעי להערכת שיעור photobleaching של צבעי FM, כמו זה הוא משמעותימקור לחפצים כאשר הדמיה שינויים קטנים בעוצמתן.
הפונקציונליות של שלפוחית סינפטית היא הקובע חשוב של שידור סינפטי. בועיות אלו לשחרר נוירוטרנסמיטרים כאשר הם מתמזגים עם קרום presynaptic הפלזמה (exocytosis), והם הופכים להיות מוכנים למחזור נוסף של שחרור לאחר שנוצר מחדש מקרום הפלזמה (אנדוציטוזה) ומחדש עם מוליך עצבי. חקר הדינמיקה של ומנגנוני מחזור שלפוחית הסינפטית כבר מואץ באופן משמעותי על ידי ההקדמה של צבעי FM styryl 1. מולקולות אלה amphipathic, אשר באופן חיובי יש לחייב קבוצות ראש הידרופילי וזנב הידרופובי (צבעים מרובים באיור 1 א ', stereoview של FM1-43 באיור 1 ב'), יכולות להיכנס ולצאת הפיך ממברנות שומנים בדם ללא מחלחל אותם. קבוצות של צבעי FM חולקים תכונות דומות המשפיעות על הטווח של אור שהם פולטים. לדוגמא, FM2-10, יש לי FM1-43, וFM1-84 קשר כפול אחד בין שתי תרכובות וsho מחזורייםפליטה ירוקה w. ההבדל ביניהם הוא אורך הזנב הידרופובי, הקובע הידרופוביות שלה, ולכן השיעור של יציאה מהקרום (departitioning). במקרים של FM5 -95 וFM4-64, שלושה קשרים כפולים לקשר תרכובות מחזוריות, והם מראים פליטה אדומה. צבעים אלו שונים ביחס לחלקים הידרופילי שלהם. בכל צבעי FM, עוצמת הקרינה עולה כאשר הם מוכנסים לתוך ממברנות ביולוגיות, כתוצאה מגידול בתשואת קוונטים בהידרופובי הסביבה ביחס לסביבה הידרופילי. לפיכך השינויים בעוצמת FM מייצגים את השינויים במחזור הממברנה. צבעים השונים (ספקטרום פליטה) וhydrophobicities להפוך FM צובע כלי מחקר מגוונים במחזור שלפוחית הסינפטית.
בהתבסס על תכונות אלה, צבעי FM משמשים בעיקר על פי התכנית הבאה בעת ניתוח מחזור שלפוחית הסינפטית (איור 2). עצבוןשל שטופים בפתרון תאי המכיל את צבע FM, המאפשר לה לנקוט לתוך שלפוחית סינפטית (SVS) כפי שהם יוצרים באמצעות אנדוציטוזה (מכתים). לצבוע לאחר מכן נשטף החוצה על ידי יישום פתרון תאי נטול צבע, זה חושף את הקצוות עצבים תפקודיים, כלומר רק את אנדוציטוזה באופן פעיל בתהליך תכיל מקבץ של שלפוחית סינפטית שנטענים עם הצבע (איור 2 תחתון). exocytosis לאחר מוביל לאובדן של צבע FM למרחב תאי ואובדן נלווה של הקרינה (destaining; בשל שני departitioning לסביבה הידרופילי ודיפוזיה מהאתר של exocytosis). לכן השינויים בעוצמת הקרינה FM הם אינדיקטורים של שלפוחית Exo-ואנדוציטוזה הסינפטי.
צבעי FM שימשו כדי להכתים וdestain שלפוחית סינפטית באורגניזמים והכנות 2,3 שונים. דוגמאות כוללות neur היונקיםתרבויות onal 4-9, פרוסות של יונקים מוח 10,11, צמתים התוקפת 12,13, הנוירונים דו קוטביים רשתית 14,15, ותאי שיער של שבלול אוזן 16.
בדרך כלל בניסויים כאלה, גם הצביעה וdestaining מופעלים על ידי הרחבת המרצת הנוירונים (הפעילות עורר). לאחרונה, עם זאת, מחזור שלפוחית הסינפטית בתגובה לגירוי חלש יש גם ניתח, כפי שיש במחזור, בהעדר גירוי חיצוני (פעילות הסינפטית ספונטנית ומיניאטורי) 9,17-19. פעילות הסינפטית ספונטנית וזעירה מוגדרות אלה המתרחשים בהיעדר גירויים חיצוניים, עם לשעבר מעורב הירי הספונטני של פוטנציאלי פעולה (איור 3). פעילות הסינפטית החלשה אלה קשורים לשינויים קטנים יותר באותות FM מאלה שמופעלים על ידי גירוי נרחב. המדידה דורשת שהשינויים בfluoresc FMעוצמת ence משקפת במדויק exocytosis הסינפטי שלפוחית או אנדוציטוזה אך שינויים לא artifactual באינטנסיביות. אחת סיבות לחפץ היא נוכחותם של כתמים ספציפיים של קרום הפלזמה על ידי צבעי FM. סחף הדרגתי של רכיב זה יביא לשינוי הדרגתי בעוצמת הקרינה שנמדדה, שיהיה מיוחס בטעות לפעילות הסינפטית. גורם זה יכול להיות מופחת על ידי שיטות מתאימות (ראה פרוטוקול). הסיבה הבולטת ביותר של החפץ היא photobleaching של צבע FM נשמרים בתוך שלפוחית סינפטית. השינויים הקשורים לphotobleaching בעוצמת FM חייבים להיות קטנים בהשוואה לשינויים הביולוגיים (הסינפטי) שנמדדו. הפיתוח האחרון של מצלמות רגישות, למשל המצלמה מכשיר תשלום מצמידים אלקטרונים הכפלה (EMCCD), מאפשר למזער photobleaching על ידי קיצור זמן חשיפה ומחליש את עוצמת האור המשמש כדי לעורר את fluorophore. סיבה נוספת לחפץ היא i להיסחףn את רמת ההתמקדות של מיקרוסקופ אור. להיסחף להתמקד במהלך פגישת הדמיה יכולה להיגרם על ידי השפעות מכאניות או תרמית, ותהיה בטעות יביא לשינוי בעוצמת הקרינה שנמדדה.
כאן אנו מתארים פרוטוקולים וציוד המאפשרים להשתמש בצבעי FM לנתח מחזור שלפוחית הסינפטית אפילו בהקשר של גירוי חלש או לא, בפרט, הפעילות הסינפטית מיניאטורי. אנחנו מראים דוגמאות לצביעה וdestaining של שלפוחית במהלך אירועים הסינפטי עוררים וספונטניים, תוך שימוש בתאי עצב בהיפוקמפוס המכרסם בתרבית, והדמית שלב destaining. אנחנו גם מדגימים כיצד להעריך את מידת photobleaching צבע FM, בהעדר כל אובדן צבע FM בשל פעילות הסינפטית.
יש לנו תארנו פרוטוקולים להכתמה וdestaining שלפוחית סינפטית בתגובה לעורר, פעילות הסינפטית ספונטנית וזעירה, והדמיה בשלב destaining. בנוסף לפרוטוקולים הקיימים, יש לנו כלל בפרוטוקול חדש של התבוננות destaining FM המבוסס על פעילות הסינפטית מיניאטורי. תוך שימוש בפרוטוקולים אלה, זיהינ?…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים לחברים במעבדה Harata לדיונים מועילים לאורך כל ביצוע עבודה זו. עבודה זו מומנה על ידי מענקים מאיגוד הלב האמריקאי, קרן דיסטוניה המחקר רפואי, Mallinckrodt אדוארד, הבן הקרן, הקרן הלאומית למדע והקרן וייטהול לNCH
Pulse generator | AMPI | Master-8 | |
Isolated stimulator | Digitimer | DS3 | |
Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100 | This is used for assessing the cell morphology at low magnification. |
Inverted microscope | Nikon | Eclipse TiE | This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift. |
Objective lens | Nikon | Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (e.g. >10 μm). | |
Filter cube | Nikon | 77032509 | 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43 |
Filter cube | Nikon | 77032809 | 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 650-nm-LP em for FM4-64. |
EMCCD camera | Andor Technology | iXon EM+ DU-860 | This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence. |
Liquid recirculating chiller | Solid State Cooling Systems | Oasis 160 | This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80°C, and thereby reducing noise. |
LED | CoolLED-Custom Interconnect | 490 nm | This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation. |
Image acquisition software | Andor Technology | Solis | |
Imaging chamber | Warner Instruments | RC-21BRFS | |
Fast perfusion system | Warner Instruments | SF-77B | |
CNQX | Tocris Bioscience | 1045 | |
D,L-AP5 | Tocris Bioscience | 0106 | |
Tetrodotoxin | Tocris Bioscience | 1069 | Caution: toxic reagent. Handle with care. |
FM1-43 | Invitrogen | T35356 | |
Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX) | Invitrogen | F35355 | |
FM4-64 | Invitrogen | T13320 | |
Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX) | Invitrogen | F34653 | |
Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
Hanks’ balanced salt | Sigma-Aldrich | H2387 | |
Minimum Essential Medium | Invitrogen | 51200-038 | This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging. |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Caution: toxic reagent. Handle with care. |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 |