Descriviamo qui una piattaforma che consente di rilevare test della cometa di danno al DNA con velocità senza precedenti. Il dispositivo modelli di cellule di mammifero in un microarray e consente l'elaborazione parallela di 96 campioni. L'approccio facilita l'analisi del danno al DNA livello di base, danno al DNA indotto da esposizione e di riparazione del DNA cinetica.
DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The ‘CometChip’ is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.
L'elettroforesi su gel singola cellula (SCGE) assay (aka il test della cometa) è una tecnica ampiamente utilizzata per la quantificazione di un ampio spettro di lesioni del DNA, tra cui lesioni di base, siti abasic, rotture singolo filamento, rotture del doppio filamento, legami crociati e alcali sensibile siti. Il principio alla base del saggio è che il DNA danneggiato migra più facilmente di DNA intatto a causa della frammentazione e perdita di struttura superelicoidale. L'entità della migrazione è proporzionale alla quantità di danno al DNA, e può essere osservata con un microscopio a fluorescenza. Immagine-cattura e analisi del profilo di intensità individuale DNA a forma di cometa quindi fornire misure di parametri quali la lunghezza della coda, coda momento, e il% di DNA nella coda di rivelare il livello di danno del DNA all'interno di una cellula 1-4.
Attualmente ci sono due versioni comunemente usato per il test della cometa: a) test della cometa alcalina e b) Comet assay neutrale. Il test della cometa alcalina è il più ampiamenteversione usata, che utilizza un buffer pH elevato per rilassarsi prima di elettroforesi del DNA e, quindi, rileva tutti i tipi di rotture dei filamenti e dei siti sensibili agli alcali. Il saggio cometa neutro, invece, è meno praticata perché utilizza un tampone neutro per mantenere le doppie eliche e rilevare solo rotture del doppio filamento 2,5. Per gli agenti chimici e fisici che inducono DSB, SSB vengono creati in concerto, e si formano a livelli molto più elevati (ad esempio, SSB γIR-indotte sono un ordine di grandezza più comune di quanto DSB). Per la maggior parte del DNA esposizioni dannose, DSB sono molto meno frequenti rispetto ad altre classi di danno al DNA, e sono quindi più difficili da rilevare. Abbiamo dimostrato in precedenti pubblicazioni finestra di rilevazione di entrambe le versioni. 6,7
Anche se il test della cometa è stata solitamente usata per la ricerca di base sui danni e riparazione del DNA e test di genotossicità 1,2,8-15, il dosaggio è stato riferito di avere scarsa riproducibilità a causa di campione-to-campione, da persona a persona e la variabilità lab-a-lab. Inoltre, il dosaggio è basso erogato, in parte perché l'acquisizione delle immagini e l'analisi dei dati sono laborioso. Insieme, queste limitazioni contribuiscono alla sua relativamente bassa accettazione in studi su larga scala. Attraverso l'integrazione di tecnologie e principi di ingegneria, la CometChip porta una soluzione ai problemi di throughput e incoerenze che sono associati con il tradizionale test della cometa 6,7. Brevemente, per creare il chip, uno stampo viene microfabbricati usando fotolitografia per creare microposts di diametro piccolo come quello di una singola cella. Lo stampo viene poi utilizzato per timbrare su agarosio fuso, causando una serie di pozzetti dopo il gel si solidifica. Chips sono state sviluppate per fornire ai ricercatori pozzi di dimensioni variabili a compatibile con diversi tipi di cellule. Per caricare il chip, le cellule in media sono autorizzati a stabilirsi nei pozzetti per gravità; cellule in eccesso vengono lavati via. Cellule intrappolati vengono poi ci incapsulatizione un sottile strato di agarosio a basso punto di fusione, e un fondo 96 pozzetti viene poi bloccato alla superficie del gel per creare 96 macrowells, ciascuna con centinaia di micropozzetti sulla sua superficie inferiore.
Questo protocollo descrive le procedure generali per esperimenti con questo chip, che comprendono la preparazione del gel, carico delle cellule, il dosaggio e la riparazione, la lisi cellulare, elettroforesi, e l'imaging fluorescente. Dimostriamo due esempi di esperimenti dose-risposta con le cellule linfoblasti esposte DNA conosciuto agenti dannosi, utilizzando alcalini e neutri versioni del test, rispettivamente. Due esperimenti di riparazione sono indicate anche per descrivere come risposta di riparazione post-esposizione può essere valutata utilizzando il sistema.
Genotossine ubiquitario nell'ambiente e anche all'interno delle cellule umane esercitano inevitabile stress e danni al DNA cellulare. In realtà, è stato stimato che ci sono 1.000 s di lesioni presenti nelle cellule umane allo stato stazionario 18 DNA. Capire danni suscettibilità e cinetica di riparazione negli esseri umani non solo porta intuizione di ricerca di base, ma beneficia anche lo sviluppo di farmaci. Ironia della sorte, nonostante la possibilità di danni al DNA per promuovere il cancro, DNA agenti dannosi sono utilizzati a livelli molto alti per curare il cancro, facendo conoscenza di danni al DNA e riparare pertinenti alla medicina personalizzata. Il CometChip è un dispositivo di ricerca romanzo che utilizza pratiche di microfabbricazione di rivoluzionare un lungo-esisteva test danno al DNA. Sulla base degli stessi principi del tradizionale test della cometa, il chip fornisce un throughput significativamente più alto e migliore riproducibilità. Descriviamo qui i metodi per l'utilizzo di questo chip. Per chiarire la sua utilità e la robustezza, mostriamo risultati from diversi esperimenti in cui il chip è stato utilizzato per valutare il danno indotto da diversi agenti che danneggiano il DNA differente, e dove è stato utilizzato per valutare la riparazione del DNA. Insieme, i risultati qui presentati forniscono informazioni utili per utilizzare il chip e dimostrano la sua ampia applicabilità per la ricerca sul danno e riparazione del DNA.
Uno dei passi più importanti di questo protocollo è quello di realizzare efficaci carico delle cellule. Molte linee cellulari sono stati testati su tale sistema, che comprende sia la sospensione e cellule aderenti. Caricamento efficienza dipende da molte variabili quali il tipo di cellule, le dimensioni delle cellule, la concentrazione di carico e di tempo. Linee cellulari di sospensione come le cellule linfoblastoidi sono le più facili da lavorare. Concentrazione di sospensione cellulare può variare dal 10 aprile – 10 giugno cellule per 96 pozzetti e caricamento di solito completa in 15-30 min. Maggiore densità cellulare facilita il carico e riduce la quantità di tempo necessario per le cellule per risolvere nei pozzetti.
Parametri di carico per cellule aderenti possono differire da cellule in sospensione. Le linee cellulari quali ovarica di criceto cinese (CHO) cellule, sono stati trovati ad avere simile efficienza di carico come cellule in sospensione (dopo tripsinizzazione) e utilizzare condizioni di carico analoghe così. Altri tipi di cellule, come le cellule tumorali che formano facilmente aggregati di cellule in sospensione, richiedono ulteriori manipolazioni. Passando sospensioni cellulari attraverso un filtro a singola cella e l'aggiunta di tripsina ai media sospensione può sopprimere la formazione di gruppi di cellule durante il caricamento. Infine, in termini di tempo di caricamento, il tempo richiesto per l'acquisizione linee cellulari aderenti nei pozzetti può variare da 20 minuti a 1 ora. Di conseguenza, si raccomanda che gli utenti eseguono esperimenti pilota per determinare le condizioni di carico ottimali, prima di procedere ad ulteriori indagini. Caricamento efficacia può essere visualizzato al microscopio in campo chiaro o più precisamente rivelato da colorazione delle cellule incapsulate con DAPI o di altro DNAmacchie prima della valutazione al microscopio a fluorescenza.
Uno dei principali vantaggi di questo metodo e chip è la versatilità. In primo luogo, i ricercatori non sono limitati ad una concentrazione cellulare di lavoro specifico perché le cellule in eccesso vengono lavate via, e il microarray assicura uniforme cometa densità. In secondo luogo, i pozzetti possono essere realizzati con dimensioni variabili per accomodare tipi cellulari di diverse dimensioni. In circostanze che più celle vengono catturati in una singola micropozzetti, comete multi-cellulari sono risultati di auto-calibrato e resa coerente rispetto alle comete monocellulari 6,7. Un altro vantaggio di patterning cellule in un microarray è che tutte le comete sono quindi allo stesso piano focale con posizioni fisse, ridurre il rumore a causa di comete sfocate e facilitare l'imaging e di analisi automatizzata. I miglioramenti significativi nella velocità e sensibilità fornite dal CometChip consentono l'applicazione del test per studi su larga scala. Nel loro insieme, il chip forniscesa strumento prezioso per la valutazione dei danni del DNA per ricercatori, tossicologi, medici ed epidemiologi.
Mentre il test della cometa è nota per la sua eccellente sensibilità nel rilevare una vasta gamma di danni al DNA, questo saggio soffre anche di bassa specificità. Usando questo protocollo migliora notevolmente la riproducibilità e la velocità del test, ma non dimostra l'avanzamento in specificità. Tuttavia, il multiplexing il test con altre metodologie è stato segnalato per essere efficace nel raggiungere una maggiore specificità. Un esempio è l'inclusione di enzimi specifici per lesione purificati. Questi enzimi possono convertire le lesioni di base altrimenti non rilevabili in rotture dei filamenti rilevabili e siti abasic 1,19-21. Un esempio ampiamente utilizzato è la riparazione endonucleasi glicosilasi formamidopyrimidine-DNA (FPG), che rivela le modifiche del DNA ossidativo 19,22. Poiché la fase di digestione enzimatica viene applicato dopo lisi cellulare, il sistema può essere trattato allo stesso modo unsa tradizionale slitta di agarosio, senza modifiche al protocollo. Anche se il protocollo dettagliato non è descritto qui, questo approccio è stato adattato da molti utenti tradizionali Comet test in passato e protocolli possono essere trovati facilmente. In una pubblicazione precedente, abbiamo usato questo metodo per identificare luce fluorescente indotto danni 22.
Il principale vantaggio di questo metodo è la velocità che fornisce, che apre le porte a studi che prima erano praticamente impossibile. La capacità di elaborare 96 campioni sulla stessa piattaforma non solo riduce il lavoro e il tempo, ma riduce anche i rumori sperimentali e migliora notevolmente la riproducibilità. Variazione Inter campione è significativamente inferiore rispetto al tradizionale variazione slide-to-scivolo, che può essere di 2 volte superiore alla variazione osservata con questo chip 6,7. Rumorosità ridotta porta anche a una maggiore sensibilità, consentendo la rilevazione di differenze più sottili tra i campioni. Poiché il dispositivo utilizza una standard formato a 96 pozzetti, che sia compatibile con le apparecchiature generale ricerca e HTS tecnologie. Si consideri uno studio che richiede la valutazione di 100 campioni, partendo dal presupposto che un ricercatore medio può elaborare ~ 30 vetrini nel corso di diversi giorni. Dato che ogni campione deve essere eseguita in triplice copia, ci sarebbe voluto circa un mese per completare un tale studio, che sarebbe anche inevitabilmente soffrono da campione a campione variazione. Al contrario, l'elaborazione di 100 condizioni, ciascuna in triplice copia, con questo chip richiede solo pochi piatti e possono essere eseguiti in tre giorni. Questo importante miglioramento del throughput apre la porta a studi che prima erano irraggiungibili.
Il protocollo presentato qui descrive entrambe le procedure di base per eseguire il test della cometa di serie e le misure modificate necessari per utilizzare la piattaforma CometChip. Con la capacità di misurare entrambi i livelli di danno al DNA inerenti e la successiva risposta di riparazione, il saggio è molto importante peruna varietà di applicazioni biologiche e cliniche. Le informazioni sull'impatto delle specifiche esposizioni chimiche sul genoma facilita la prevenzione e la cura delle malattie. Inoltre, vi è anche un interesse significativo nel determinare variazioni nel DNA danni sensibilità e capacità di riparazione tra gli individui 23,24. Questa tecnica fornisce il throughput richiesto per tali studi su larga scala. La conoscenza inter-variazioni individuali è fondamentale per identificare le persone sensibili e per la progettazione di terapie individualizzate o strategie prevenzioni. Nel loro insieme, la tecnologia qui presentato fornisce un elevato throughput, piattaforma di analisi del danno al DNA oggettiva e quantitativa che ha il potenziale per diventare una metodologia standard nel prossimo futuro.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato essenzialmente il sostegno da 5-UO1-ES016045 con il parziale supporto da 1-R21-R44-ES019498 e ES021116. DMW è stato sostenuto dal NIEHS Training Grant Tossicologia ambientale T32-ES007020. Attrezzatura è stato fornito dal Centro per le Scienze Salute ambientale P30-ES002109.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
UltraPure LMP Agarose (low melting point) | Invitrogen | 16520 | Multiple suppliers |
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco by life technologies | 14190 | Multiple suppliers |
Crystalline NaCl | Macron Chemicals | 7581-06 | Multiple suppliers |
Crystalline Na2EDTA | Macron Chemicals | 4931-04 | Multiple suppliers, Irritant |
Crystalline Tris (base) | Sigma-Aldrich | T1503 | Multiple suppliers, Irritant |
Crystalline Tris (acid) | J.T.Baker | 4106 | Multiple suppliers |
Crystalline N-lauroylsarcosine | Sigma-Aldrich | L9150 | Multiple suppliers, Highly toxic by inhalation, Irritant |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Multiple suppliers, Harmful by ingestion., Irritant |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | Multiple suppliers, Combustible Liquid, Target Organ Effect |
Crystalline NaOH | Macron Chemicals | 7708-06 | Multiple suppliers, Corrosive |
Hydrochloric acid | VWR | BDH3871 | Multiple suppliers, Corrosive |
Crystalline boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | Multiple suppliers, Target Organ Effect, Teratogen, Reproductive hazard |
Name of Equipments | Company | Catalog Number | Comments |
CometChip | Trevigen | Under development for distribution, contact Trevigen directly to obtain materials necessary | |
1-well dish | Thomas Scientific | 73521-420 | |
Bottomless 96-wel plate | VWR | 655000-06 | |
1.5″ binder clips | Staples | Multiple suppliers | |
Glass plate | Tag Hardware | Customized to size of 96-well plate | |
Owl Horizontal Electrophoresis System | VWR | 27372-131 | Multiple suppliers |
PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | Multiple suppliers |