عزل Myofibroblasts الابتدائية من ماوس والأنسجة البشرية القولون
Summary
والأرومة الليفية العضلية هي الخلية اللحمية تأثيرا في الجهاز الهضمي الذي ينظم العمليات الفسيولوجية الهامة في الدول العادية والمرض. نحن تصف تقنية تسمح لعزل myofibroblasts الأساسي من كلا الماوس والأنسجة القولون الإنسان، والتي يمكن استخدامها في المختبر لالتجريب.
Abstract
والأرومة الليفية العضلية هي خلايا انسجة الجهاز الهضمي من (GI) المسالك التي تم تكتسب اهتماما كبيرا لدورها الحاسم في كثير من وظائف الجهاز الهضمي. في حين أن العديد من خطوط الخلايا الأرومة الليفية العضلية المتاحة تجاريا لدراسة هذه الخلايا في المختبر، ونتائج البحوث من خط الخلية تتعرض لظروف تجريبية ثقافة الخلية على قيود متأصلة نظرا لطبيعة اختزالية بشكل مفرط من العمل. استخدام myofibroblasts الأولية يقدم ميزة كبيرة من حيث تؤكد النتائج التجريبية التي تم تحديدها في خط الخلية. عزل myofibroblasts الأولية من نموذج حيواني يسمح لدراسة myofibroblasts ظل الظروف التي تحاكي بشكل وثيق الدولة الأمراض التي تجري دراستها. عزل myofibroblasts الأولية من الأنسجة القولون الإنسان يوفر يمكن القول إن معظم البيانات التجريبية ذات الصلة، منذ الخلايا تأتي مباشرة من المرضى الذين يعانون من هذا المرض الأساسي. نحن تصف تقنية راسخة يمكن أن تكون شtilized لعزل myofibroblasts الأساسي من كلا الماوس والأنسجة القولون الإنسان. وقد اتسمت هذه الخلايا أن تكون معزولة أكتين ألفا العضلات الملساء وvimentin إيجابية، وdesmin السلبية، بما يتفق مع myofibroblasts المعوية تحت الظهارة. يمكن زراعتها خلايا الأرومة الليفية العضلية الأولية في خلية ثقافة وتستخدم لأغراض تجريبية على عدد محدود من المقاطع.
Introduction
تنظيم الجهاز الهضمي (GI) وظيفة الجهاز ينطوي المعقدة، والتفاعلات الدينامية بين الطبقة المخاطية واللحمة المتوسطة الكامنة. هذه التفاعلات تخدم عادة للحفاظ على التوازن ولكن قد يؤدي أيضا إلى تطوير الحالات المرضية في ظل ظروف مرضية 1. Myofibroblasts هي جزء من السكان من الخلايا اللحمية تقع تحتاني إلى الطبقة الظهارية التي تتصل بطريقة نظير الصماوي مع توضيح المجموعات السكانية الفرعية خلية لتنظيم عدد من العمليات الحرجة الجهاز الهضمي والتي تشمل تجديد الغشاء المخاطي، والإصلاح، والتليف 2.
خط الخلية 18Co هو مثال على القولون خط الخلية البشرية الأرومة الليفية العضلية التي استخدمت على نطاق واسع لدراسة وظيفة الأرومة الليفية العضلية لأنها تشترك في كثير من الخصائص من التعليم الابتدائي في myofibroblasts الموقع. وتشمل هذه تعبير البروتين من العضلات على نحو سلس الأكتين (α-SMA) وvimentin، فضلا عن التعبير عن عددمن مستقبلات سطح الخلية مثل مستقبلات عامل نمو البشرة، أو مستقبلات حمض 3،4 lysophosphatidic. بسبب هذه الخصائص التركيبية المشتركة، فضلا عن التشابه في وظيفة بيولوجية 5، وقد استخدم خط الخلية 18Co على نطاق واسع لدراسة وظيفة الأرومة الليفية العضلية في سياق العديد من الحالات المرضية مثل مرض التهاب الأمعاء أو القولون والمستقيم 3،6 السرطان. ومع ذلك، هناك قيود والمخاوف المتأصلة عند استخدام خط الخلية. وتشمل هذه عدم الاستقرار الوراثي بمرور الوقت التي تميز خطوط الخلايا من الخلايا الأولية، وتغيير النمط الظاهري وظيفة بيولوجية الخلية، بما في ذلك معدلات النمو والتفاعل مع السكان الخلية الأخرى. تفتقر خطوط الخلايا أيضا مكونات طبيعية من المكروية GI (الظهارية، اللحمية، ومكونات الأوعية الدموية)، والذي يشكل قيدا رئيسيا لاستخدامه. وبالتالي، فإن الاستنتاجات المستخلصة من البحوث التجريبية خط الخلية يتطلب مزيدا من التحقق من صحة للحد من ريكورونا من سوء التفسير.
ويمكن الحصول على myofibroblasts الأولية من الأنسجة القولون الإنسان والفأر لتأكيد النتائج التجريبية التي تم تحديدها في خط الخلية 7. طريقة وصفت في الأصل من قبل Mahida، وآخرون. 8، وبروتوكول لدينا هي واحدة من العديد من التقنيات موصوفة وصفا جيدا والتي يمكن استخدامها لعزل myofibroblasts الأولية من الماوس والقولون الإنسان 9. عن أي نموذج الفأر من مرض القولون، هذه التقنية يمكن استخدامها لعزل myofibroblasts الأولية لدراسة كيفية تفاعلها مع الخلايا المجاورة أو المساهمة في الظروف العادية أو عمليات GI مرضية 10،11. هذه التقنية يمكن استخدامها لدراسة كيفية مساهمة myofibroblasts إلى المخاطية الشفاء، والتليف، وتطوير أورام القولون والمستقيم وسرطان. كما يمكن الحصول على myofibroblasts الأولية من الأنسجة القولون الإنسان التي تم مقطوعة في وقت التشغيل لحميدة (مرض التهاب الأمعاء، والقيود، انسدادات) أو ج الخبيثةonditions. يمكن زراعتها الخلايا الأولية المعزولة من أنسجة القولون الإنسان والفأر في المزارع الخلوية والاستفادة منها على عدد محدود من المقاطع.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقنية عامة مشابهة عند استخدام إما الماوس أو القولون الإنسان. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية لعزل myofibroblasts من الأمعاء الدقيقة. تفاصيل محددة لعزل myofibroblasts من 1. الماوس و 2. وتناقش القولون البشري أدناه.
1. الماوس القولون
<p class="jove_content" s…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح 5KO8DK085136-02 لJY.
Materials
Table of specific reagents and equipment:
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Dispase I | Invitrogen/GIBCO | #17105-041 | |
| Collagenase D | Roche | #1 088 858 | |
| 4 in, 16 G Popper blunt-end needle | Fisher | #14-825-16K |
References
- Armaka, M., et al. Mesenchymal cell targeting by TNF as a common pathogenic principle in chronic inflammatory joint and intestinal diseases. J. Exp. Med. 205, 331-337 (2008).
- Powell, D. W., et al. Paracrine cells important in health and disease. Am. J. Physiol. 277, C1-C9 (1999).
- Yoo, J., Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. Protein kinase D1 mediates synergistic MMP-3 expression induced by TNF-alpha and bradykinin in human colonic myofibroblasts. Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 30-35 (2011).
- Yoo, J., Chung, C., Slice, L., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. Protein kinase D mediates synergistic expression of COX-2 induced by TNF-{alpha} and bradykinin in human colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1576-C1587 (2009).
- Valentich, J. D., Popov, V., Saada, J. I., Powell, D. W. Phenotypic characterization of an intestinal subepithelial myofibroblast cell line. Am. J. Physiol. 272, C1513-C1524 (1997).
- Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E., Yoo, J. TNF-alpha potentiates lysophosphatidic acid-induced COX-2 expression via PKD in human colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300, G637-G646 (2011).
- Yoo, J., et al. TNF-alpha induces upregulation of EGFR expression and signaling in human colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 302, G805-G814 (2012).
- Mahida, Y. R., et al. Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2. Am. J. Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).
- De Wever, O., et al. Priming and potentiation of DNA damage response by fibronectin in human colon cancer cells and tumor-derived myofibroblasts. Int. J. Oncol. 39, 393-400 (2011).
- Edwards, R. A., Smock, A. Z. Defective arachidonate release and PGE2 production in Gi alpha2-deficient intestinal and colonic subepithelial myofibroblasts. Inflamm. Bowel Dis. 12, 153-165 (2006).
- Hoang, B., Trinh, A., Birnbaumer, L., Edwards, R. A. Decreased MAPK- and PGE2-dependent IL-11 production in Gialpha2-/- colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 292, G1511-G1519 (2007).
- Li, Z. B., Kollias, H. D., Wagner, K. R. Myostatin directly regulates skeletal muscle fibrosis. J. Biol. Chem. 283, 19371-19378 (2008).
- Saada, J. I., et al. Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa. J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).
- Lahar, N., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts support in vitro and in vivo growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 6, e26898 (2011).
