Isolation des myofibroblastes primaires de souris et de tissus du côlon humain
Summary
Le myofibroblastes est une cellule influent stromale du tractus gastro-intestinal qui régule les processus physiologiques importants dans les états normaux et pathologiques. Nous décrivons une technique qui permet l'isolement des myofibroblastes primaires à partir de la souris et le tissu du côlon humain, qui peut être utilisé pour l'expérimentation in vitro.
Abstract
Le myofibroblastes est une cellule stromale de l'appareil gastro-intestinal (GI) qui a gagné une attention considérable de son rôle essentiel dans de nombreuses fonctions gastro-intestinales. Bien que plusieurs lignées cellulaires myofibroblastes sont disponibles dans le commerce pour étudier ces cellules in vitro, les résultats de la recherche provenant d'une lignée de cellules exposées à des conditions de culture de cellules expérimentales ont des limites inhérentes dues à la nature trop réductrice de l'œuvre. L'utilisation de myofibroblastes primaires offre un grand avantage en termes de confirmer les résultats expérimentaux identifiés dans une lignée cellulaire. Isolement des myofibroblastes primaires à partir d'un modèle animal pour l'étude permet de myofibroblastes dans des conditions qui imitent plus près de l'état pathologique en cours d'étude. Isolation des myofibroblastes primaires de tissus du côlon humain fournit sans doute des données expérimentales les plus pertinentes, car les cellules viennent directement de patients atteints de la maladie sous-jacente. Nous décrivons une technique bien établie qui peut être utilized pour isoler myofibroblastes primaires à partir de la souris et le tissu du côlon humain. Ces cellules isolées ont été caractérisées pour être l'alpha-actine musculaire lisse et la vimentine positif, et la desmine négatif, compatible avec les myofibroblastes sous-épithéliaux intestinaux. Cellules de myofibroblastes primaires peuvent être cultivées dans une culture cellulaire et utilisés à des fins expérimentales sur un nombre limité de passages.
Introduction
La régulation de la fonction gastro-intestinale (GI), implique des interactions complexes et dynamiques entre la couche de muqueuse et son mésenchyme sous-jacent. Ces interactions servent normalement à maintenir l'homéostasie, mais peuvent également conduire au développement d'états pathologiques dans des conditions pathologiques 1. Les myofibroblastes sont une sous-population de cellules du stroma sous-jacent qui se trouvent à la couche epitheliale qui communiquent dans un mode paracrine environnante avec des sous-populations de cellules pour réguler un certain nombre de processus critiques tractus gastro-intestinal comprenant la régénération de la muqueuse, la réparation, la fibrose et 2.
La lignée cellulaire 18Co est un exemple d'une lignée humaine du colon des myofibroblastes cellulaire qui a été largement utilisé pour étudier la fonction des myofibroblastes, car il partage un grand nombre des caractéristiques de primaire en myofibroblastes in situ. Il s'agit notamment de l'expression de la protéine d'a-actine du muscle lisse (α-SMA) et la vimentine, ainsi que l'expression d'un certain nombredes récepteurs de surface cellulaire tels que le récepteur épidermique de facteur de croissance, ou des récepteurs pour 3,4 de l'acide lysophosphatidique. En raison de ces caractéristiques ultrastructurales communes, ainsi que des similitudes dans la fonction biologique 5, la lignée cellulaire 18Co a été largement utilisée pour étudier la fonction des myofibroblastes dans le cadre de nombreux états pathologiques comme la maladie inflammatoire de l'intestin ou 3,6 du cancer colorectal. Cependant, il ya des limites et des préoccupations inhérentes lors de l'utilisation d'une lignée cellulaire. Il s'agit notamment de l'instabilité génotypique au cours du temps qui se différencie des lignées cellulaires à partir de cellules primaires, en modifiant le phénotype et la fonction biologique de la cellule, y compris les taux et les interactions avec d'autres populations cellulaires croissance. Les lignées cellulaires n'ont pas non plus les composantes normales du micro-environnement de GI (épithéliales, stromales, et des composants vasculaires), ce qui est un obstacle majeur à leur utilisation. Par conséquent, les conclusions tirées de la recherche en ligne de cellule expérimentale nécessite une validation supplémentaire pour réduire la risk de mauvaise interprétation.
Myofibroblastes primaires peuvent être obtenus à partir de tissus de côlon humain et la souris pour confirmer les résultats expérimentaux identifiés dans une lignée cellulaire 7. La méthode a été décrite à l'origine par Mahida et al. Huit, et notre protocole est une des nombreuses techniques bien décrits qui peuvent être utilisés pour isoler des myofibroblastes primaires à partir de la souris et du côlon humain 9. Pour tout modèle de souris de la maladie du côlon, cette technique peut être utilisée pour isoler les myofibroblastes primaires pour étudier la façon dont ils interagissent avec les cellules voisines ou contribuer à la fois normal ou pathologique GI traite 10,11. Cette technique peut être utilisée pour étudier comment les myofibroblastes contribuent à la cicatrisation des muqueuses, de la fibrose, et le développement d'adénomes et de carcinomes colorectaux. Myofibroblastes primaires peuvent également être obtenus à partir de tissu de colon humain qui a été réséqué au moment de l'opération de bénigne (maladie inflammatoire de l'intestin, les sténoses, la diverticulite) ou c malinonditions. Les cellules primaires isolées à partir de tissu de côlon humain et de souris peuvent être cultivées dans une culture de cellules et utilisées sur un nombre limité de passages.
Protocol
Representative Results
Discussion
La technique générale est similaire pour l'utilisation de la souris ou l'autre ou du côlon humain. Cette technique peut également être utilisée pour isoler des myofibroblastes par l'intestin grêle. Les détails spécifiques pour l'isolement des myofibroblastes de 1. souris et 2. côlon humain sont discutés ci-dessous.
Une. Colon souris
L'irrigation du colon de la souris est facilitée par la fixation d'un 4 à 16 G Popper aiguille à …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé Grant 5KO8DK085136-02 à JY.
Materials
Table of specific reagents and equipment:
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Dispase I | Invitrogen/GIBCO | #17105-041 | |
| Collagenase D | Roche | #1 088 858 | |
| 4 in, 16 G Popper blunt-end needle | Fisher | #14-825-16K |
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