בידוד של ראשוני myofibroblasts מעכבר ורקמות מעי גס אנושיים
Summary
Myofibroblast הוא תא סטרומה השפעה של מערכת העיכול המווסת את התהליכים פיסיולוגיים חשובים במדינות שניהם נורמליות ומחלה. אנו מתארים טכניקה המאפשרת בידוד של myofibroblasts העיקרי משני בעכבר ורקמת מעי גס אנושית, אשר יכול להיות מנוצל לניסויים במבחנה.
Abstract
Myofibroblast הוא תא סטרומה של מערכת העיכול (GI), שכבר צוברת תשומת לב רבה לתפקידה החיוני בפונקציות במערכת העיכול רבות. בעוד כמה שורות תאי myofibroblast זמינות מסחרי ללמוד תאים אלה במבחנה, יש תוצאות מחקר משורת תאים שנחשפה לתנאי תרבית תאים ניסיוניים מגבלות מובנות בשל האופי מדי רדוקציוניסטית של העבודה. שימוש בmyofibroblasts העיקרי מציע יתרון גדול במונחים של מאשר ממצאי ניסוי שזוהו בשורת תאים. בידוד של myofibroblasts העיקרי ממודל חיה מאפשר לחקר myofibroblasts בתנאים המחקים באופן הדוק יותר נחקרים מצב המחלה. בידוד של myofibroblasts העיקרי מרקמות מעי גס אנושיות מספק לטעון את נתוני ניסוי הרלוונטיים ביותר, שכן התאים מגיעים ישירות מחולים עם המחלה הבסיסית. אנו מתארים טכניקה מבוססת היטב כי יכול להיות utilized לבודד myofibroblasts העיקרי משני בעכבר ורקמת מעי גס אנושית. תאים מבודדים אלה מאופיינים להיות אקטין אלפא שריר החלק וvimentin חיובי, וdesmin שלילי, עולה בקנה אחד עם myofibroblasts המעיים subepithelial. ניתן לגדל תאי myofibroblast ראשוניים בתרבית תאים ומשמשים למטרות ניסוי על מספר מצומצם של מעברים.
Introduction
הרגולציה של תפקוד מערכת (GI) במערכת העיכול כוללת אינטראקציות מורכבות, דינמיות בין השכבה הרירית וmesenchyme הבסיסי שלה. אינטראקציות אלה בדרך כלל לשמש כדי לשמור על איזון, אך עשויה גם להוביל להתפתחות של מדינות מחלה בתנאים פתולוגיים 1. Myofibroblasts הוא subpopulation של תאי סטרומה ממוקמים subjacent לשכבת האפיתל המתקשרות באופן אוטוקריני עם סובבי אוכלוסיות תא לווסת את מספר תהליכי מערכת העיכול הקריטיים הכוללים התחדשות רירית, תיקון, וסיסטיק 2.
שורת תאי 18Co היא דוגמא לקו אדם הגס myofibroblast תא שכבר בשימוש נרחב ללמוד לתפקד myofibroblast משום שהיא חולקת רבות ממאפייני העיקריים בmyofibroblasts אתרו. אלה כוללים את ביטוי החלבון של חלק אקטין שריר (α-SMA) וvimentin, כמו גם ביטוי של מספרשל קולטני תא שטח כגון צמיחת אפידרמיס גורם הקולטן, או קולטנים ל3,4 חומצת lysophosphatidic. בגלל מאפיינים אלה משותפים ultrastructural, כמו גם קווי הדמיון בתפקוד ביולוגי 5, שורת תאי 18Co כבר נעשה שימוש נרחב ללמוד לתפקד myofibroblast בהקשר של מדינות מחלה רבות כגון מחלת מעי דלקתית או 3,6 סרטן מעי גס. עם זאת, יש מגבלות וחששות בעת שימוש בקו סלולרי. אלה כוללים חוסר יציבות genotypic לאורך זמן שמבדיל את שורות תאים מהתאים ראשוניים, לשנות את הפנוטיפ ותפקוד ביולוגי של התא, כולל שיעורי צמיחה ואינטראקציות עם אוכלוסיות תאים אחרות. שורות תאים גם חוסר הרכיבים הרגילים של microenvironment GI (אפיתל, סטרומה, ורכיבים של כלי דם), שהיא מגבלה העיקרית לשימוש בו. לכן, המסקנות שהוסקה ממחקר קו הסלולרי ניסיוני דורשת אימות נוספת כדי לצמצם את ריsk של פרשנות שגויה.
ניתן להשיג מרקמות מעי גס אנושיות ועכבר myofibroblasts העיקרי כדי לאשר את ממצאי ניסויים שזוהו בשורת תאי 7. השיטה שתוארה במקור על ידי Mahida, et al. 8, והפרוטוקול שלנו הוא אחת טכניקות רבות תיארו היטב, שניתן להשתמש כדי לבודד myofibroblasts העיקרי מעכבר והמעי גס אנושי 9. לכל מודל של עכברים של מחלה במעי הגס, טכניקה זו יכולה לשמש כדי לבודד myofibroblasts העיקרי כדי ללמוד כיצד הם פועלים עם תאי שכנים או לתרום לשניהם רגילים או במערכת העיכול פתולוגיים מעבדת 10,11. טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי ללמוד איך myofibroblasts לתרום לריפוי רירי, סיסטיק, והפיתוח של אדנומות וקרצינומות של מעי גס. יכול גם להיות מושגת myofibroblasts העיקרי מרקמות מעי גס אנושיות שכבר עברו כריתה בזמן מבצע ל( מחלה דלקתית של מעי, מגבלות, דיברטיקוליטיס) שפיר או ממאיר גonditions. תאים ראשוניים מבודדים מרקמת מעי גס אנושית ועכבר ניתן לגדל בתרבית תאים ומנוצלים על מספר מוגבל של מעברים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הטכניקה הכללית היא דומה בעת שימוש או עכבר או מעי גס אנושי. גם טכניקה זו יכולה לשמש כדי לבודד myofibroblasts מהמעי הדק. פרטים ספציפיים עבור הבידוד של myofibroblasts מ1. עכבר ו2. מעי גס אנושי הם דנו בהמשך.
1. קולון מאוס
<p class="jove_content" style=";text-align:right;directi…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות גרנט 5KO8DK085136-02 לJY.
Materials
Table of specific reagents and equipment:
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Dispase I | Invitrogen/GIBCO | #17105-041 | |
| Collagenase D | Roche | #1 088 858 | |
| 4 in, 16 G Popper blunt-end needle | Fisher | #14-825-16K |
References
- Armaka, M., et al. Mesenchymal cell targeting by TNF as a common pathogenic principle in chronic inflammatory joint and intestinal diseases. J. Exp. Med. 205, 331-337 (2008).
- Powell, D. W., et al. Paracrine cells important in health and disease. Am. J. Physiol. 277, C1-C9 (1999).
- Yoo, J., Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. Protein kinase D1 mediates synergistic MMP-3 expression induced by TNF-alpha and bradykinin in human colonic myofibroblasts. Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 30-35 (2011).
- Yoo, J., Chung, C., Slice, L., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. Protein kinase D mediates synergistic expression of COX-2 induced by TNF-{alpha} and bradykinin in human colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1576-C1587 (2009).
- Valentich, J. D., Popov, V., Saada, J. I., Powell, D. W. Phenotypic characterization of an intestinal subepithelial myofibroblast cell line. Am. J. Physiol. 272, C1513-C1524 (1997).
- Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E., Yoo, J. TNF-alpha potentiates lysophosphatidic acid-induced COX-2 expression via PKD in human colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300, G637-G646 (2011).
- Yoo, J., et al. TNF-alpha induces upregulation of EGFR expression and signaling in human colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 302, G805-G814 (2012).
- Mahida, Y. R., et al. Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2. Am. J. Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).
- De Wever, O., et al. Priming and potentiation of DNA damage response by fibronectin in human colon cancer cells and tumor-derived myofibroblasts. Int. J. Oncol. 39, 393-400 (2011).
- Edwards, R. A., Smock, A. Z. Defective arachidonate release and PGE2 production in Gi alpha2-deficient intestinal and colonic subepithelial myofibroblasts. Inflamm. Bowel Dis. 12, 153-165 (2006).
- Hoang, B., Trinh, A., Birnbaumer, L., Edwards, R. A. Decreased MAPK- and PGE2-dependent IL-11 production in Gialpha2-/- colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 292, G1511-G1519 (2007).
- Li, Z. B., Kollias, H. D., Wagner, K. R. Myostatin directly regulates skeletal muscle fibrosis. J. Biol. Chem. 283, 19371-19378 (2008).
- Saada, J. I., et al. Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa. J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).
- Lahar, N., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts support in vitro and in vivo growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 6, e26898 (2011).
