Isolering av primær myofibroblasts fra Mouse and Human Colon Tissue
Summary
Den myofibroblast er en innflytelsesrik stromal celle i mage-tarmkanalen som regulerer viktige fysiologiske prosesser i både normal og sykdomstilstander. Vi beskriver en teknikk som gjør det mulig for isolering av primære myofibroblasts fra både mus og human colon vev, noe som kan benyttes for in vitro-eksperimenter.
Abstract
Den myofibroblast er et stromal celle i gastrointestinale (GI)-tarmkanalen som er blitt stadig mer betydelig oppmerksomhet for sin kritisk rolle i mange gastrointestinale funksjoner. Mens flere myofibroblast cellelinjer som er kommersielt tilgjengelig for å studere disse cellene in vitro, forskningsresultater fra en cellelinje som utsettes for eksperimentelle cellekulturbetingelser har iboende begrensninger på grunn av den altfor reductionist arbeidets art. Bruk av primær myofibroblasts tilbyr en stor fordel når det gjelder å bekrefte eksperimentelle funn identifisert i en cellelinje. Isolering av primære myofibroblasts fra en dyremodell gjør det mulig for studiet av myofibroblasts under betingelser som nærmere etterligner den sykdomstilstand som blir studert. Isolering av primær myofibroblasts fra menneskets tykktarm vev gir uten tvil de mest relevante eksperimentelle data, siden cellene kommer direkte fra pasienter med underliggende sykdom. Vi beskriver en veletablert teknikk som kan være utilized å isolere primære myofibroblasts fra både mus og menneskets tykktarm vev. Disse isolerte celler har blitt karakterisert til å være alfa-glattmuskel-aktin-og vimentin-positive og desmin-negative, i overensstemmelse med subepithelial tarm myofibroblasts. Primære myofibroblast celler kan dyrkes i cellekultur, og som brukes for eksperimentelle formål enn et begrenset antall passasjer.
Introduction
Reguleringen av gastrointestinal (GI) tarmkanalen funksjon involverer komplekse, dynamiske samspillet mellom slimhinnen og dens underliggende mesenchyme. Disse interaksjonene er normalt å opprettholde homeostase, men kan også føre til utvikling av sykdomstilstander i henhold patologiske tilstander en. Myofibroblasts er en undergruppe av stromale celler lokalisert underliggende til epitellaget som kommuniserer på en paracrine mote med omkringliggende cellepopulasjoner for å regulere en rekke kritiske GI veis prosesser som inkluderer slimhinne gjenfødelse, reparasjon, og fibrose to.
Den 18Co-cellelinjen er et eksempel på en human colonic myofibroblast cellelinje som har blitt mye brukt for å studere myofibroblast funksjon fordi den deler mange av egenskapene til primær in situ myofibroblasts. Disse inkluderer protein ekspresjon av a-glattmuskel-aktin (α-SMA) og vimentin, så vel som ekspresjon av en rekkeav celleoverflatereseptorer som for eksempel epidermal vekstfaktor-reseptor, eller reseptorer for lysofosfatidisk syre 3,4. På grunn av disse delte ultrastrukturelle karakteristika, så vel som likheter i biologiske funksjonen 5, har 18Co-cellelinjen blitt brukt i stor utstrekning for å studere myofibroblast funksjon i sammenheng med mange sykdomstilstander slik som inflammatorisk tarmsykdom eller kolorektal kreft 3,6. Det er imidlertid iboende begrensninger og problemer ved bruk av en cellelinje. Disse omfatter genotypisk ustabilitet over tid som skiller cellelinjer fra primære celler, forandre fenotypen og biologiske funksjonen av cellen, inkludert vekstrater og interaksjoner med andre cellepopulasjoner. Cellelinjer som mangler også de vanlige komponenter i GI mikromiljøet (epitelial, stromal og vaskulære komponenter), som er en viktig begrensning for bruken. Derfor konklusjonene fra eksperimentelle cellelinje forskning krever ytterligere validering for å redusere risk av feiltolkning.
Primære myofibroblasts kan fås fra mennesker og mus kolon vev for å bekrefte eksperimentelle funn identifisert i en cellelinje 7. Metoden ble opprinnelig beskrevet av Mahida, et al. Åtte, og vår protokoll er en av mange vel-beskrevne teknikker som kan brukes til å isolere primære myofibroblasts fra mus og human tykktarm 9. For noen mus modell sykdom i kolon, kan denne teknikken brukes til å isolere primære myofibroblasts å studere hvordan de samhandler med nabocellene eller bidra til både normal eller patologisk GI prosesser 10,11. Denne teknikken kan brukes til å studere hvordan myofibroblasts bidrar til slimhinnetilheling, fibrose, og utvikling av kolorektal adenom og karsinom. Primære myofibroblasts kan også fås fra humant colon vev som er fjernet, ved tidspunktet for operasjonen for godartet (inflammatorisk tarmsykdom, strikturer, divertikulitt) eller ondartet conditions. Isolerte primære celler fra menneske og mus colon vev kan dyrkes i cellekultur og benyttet over et begrenset antall passasjer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den generelle teknikken er lik når du bruker enten mus eller menneskets tykktarm. Denne teknikken kan også brukes til å isolere myofibroblasts fra tynntarmen. Spesifikke detaljer for isolering av myofibroblasts fra en. mus og 2.. menneskets tykktarm er omtalt nedenfor.
En. Mus Colon
Vanning av muse colon lettes ved å feste en 4 i, 16 G Popper butt-ende-nål til den ene enden av tykktarmen. Dette hjelper også når du skjærer tykktarmen på langs. Du kan trekksp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grant 5KO8DK085136-02 til JY.
Materials
Table of specific reagents and equipment:
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Dispase I | Invitrogen/GIBCO | #17105-041 | |
| Collagenase D | Roche | #1 088 858 | |
| 4 in, 16 G Popper blunt-end needle | Fisher | #14-825-16K |
References
- Armaka, M., et al. Mesenchymal cell targeting by TNF as a common pathogenic principle in chronic inflammatory joint and intestinal diseases. J. Exp. Med. 205, 331-337 (2008).
- Powell, D. W., et al. Paracrine cells important in health and disease. Am. J. Physiol. 277, C1-C9 (1999).
- Yoo, J., Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. Protein kinase D1 mediates synergistic MMP-3 expression induced by TNF-alpha and bradykinin in human colonic myofibroblasts. Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 30-35 (2011).
- Yoo, J., Chung, C., Slice, L., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. Protein kinase D mediates synergistic expression of COX-2 induced by TNF-{alpha} and bradykinin in human colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1576-C1587 (2009).
- Valentich, J. D., Popov, V., Saada, J. I., Powell, D. W. Phenotypic characterization of an intestinal subepithelial myofibroblast cell line. Am. J. Physiol. 272, C1513-C1524 (1997).
- Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E., Yoo, J. TNF-alpha potentiates lysophosphatidic acid-induced COX-2 expression via PKD in human colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300, G637-G646 (2011).
- Yoo, J., et al. TNF-alpha induces upregulation of EGFR expression and signaling in human colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 302, G805-G814 (2012).
- Mahida, Y. R., et al. Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2. Am. J. Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).
- De Wever, O., et al. Priming and potentiation of DNA damage response by fibronectin in human colon cancer cells and tumor-derived myofibroblasts. Int. J. Oncol. 39, 393-400 (2011).
- Edwards, R. A., Smock, A. Z. Defective arachidonate release and PGE2 production in Gi alpha2-deficient intestinal and colonic subepithelial myofibroblasts. Inflamm. Bowel Dis. 12, 153-165 (2006).
- Hoang, B., Trinh, A., Birnbaumer, L., Edwards, R. A. Decreased MAPK- and PGE2-dependent IL-11 production in Gialpha2-/- colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 292, G1511-G1519 (2007).
- Li, Z. B., Kollias, H. D., Wagner, K. R. Myostatin directly regulates skeletal muscle fibrosis. J. Biol. Chem. 283, 19371-19378 (2008).
- Saada, J. I., et al. Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa. J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).
- Lahar, N., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts support in vitro and in vivo growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 6, e26898 (2011).
