Isolamento de primárias Miofibroblastos de Mouse e tecido do cólon humano
Summary
O miofibroblastos é uma célula estromal influente do tracto gastrointestinal, que regula os processos fisiológicos importantes em estados normais e de doença. Descrevemos uma técnica que permite o isolamento de miofibroblastos primários de rato e tanto o tecido do cólon humano, o que pode ser utilizado para experimentação in vitro.
Abstract
O miofibroblastos é uma célula estromal do tracto gastrointestinal (GI) que tem vindo a ganhar uma atenção considerável para o seu papel fundamental em muitas funções gastrointestinais. Enquanto várias linhas de células de miofibroblastos são comercialmente disponíveis para estudar estas células in vitro, os resultados da pesquisa de uma linha de células expostas a condições de cultura de células experimentais têm limitações inerentes devido à natureza excessivamente redutora do trabalho. Utilização de miofibroblastos primárias oferece uma grande vantagem em termos de resultados experimentais, confirmando identificados numa linha celular. Isolamento de miofibroblastos primárias a partir de um modelo animal, permite o estudo dos miofibroblastos, em condições que mais de perto simulam o estado da doença a ser estudada. Isolamento de miofibroblastos primários de tecido do cólon humano oferece, sem dúvida, os dados experimentais mais relevantes, uma vez que as células vêm diretamente de pacientes com a doença de base. Nós descrevemos uma técnica bem estabelecida, que pode ser utilized isolar myofibroblasts primários do mouse e do tecido do cólon humano. Estas células isoladas foram caracterizadas como actina alfa de músculo liso e vimentina-positivas, e desmina-negativos, de acordo com miofibroblastos subepiteliais intestinais. Células de miofibroblastos primárias podem ser cultivadas em cultura de células e utilizadas para fins experimentais mais de um número limitado de passagens.
Introduction
A regulação da função do trato gastrointestinal (GI), envolve interações dinâmicas complexas entre a camada mucosa e seu mesênquima subjacente. Estas interacções normalmente servem para manter a homeostase, mas também pode levar ao desenvolvimento de estados de doença, em condições patológicas 1. Os miofibroblastos são uma subpopulação de células estromais localizados subjacente à camada epitelial que comunicar de uma forma parácrina com áreas subpopulações de células para regular um número de processos críticos do tracto GI que incluem regeneração das mucosas, reparação, e fibrose 2.
A linha celular de 18Co é um exemplo de uma linha celular humana do cólon miofibroblastos que tem sido amplamente utilizado para estudar a função de miofibroblastos porque partilha muitas das características de primário em miofibroblastos situ. Estes incluem a expressão de proteínas de um-actina de músculo liso (α-SMA) e vimentina, bem como a expressão de uma sériede receptores de superfície celular, tais como o receptor do factor de crescimento epidérmico, ou receptores de 3,4 ácido lisofosfatídico. Devido a estas características ultra-estruturais comuns, bem como similaridades na função biológica 5, a linha de células de 18Co tem sido amplamente utilizado para estudar a função de miofibroblastos no contexto de muitos estados de doença, tais como a doença inflamatória do intestino ou 3,6 cancro colorectal. No entanto, existem limitações inerentes e preocupações na utilização de uma linha celular. Estes incluem a instabilidade genotípica ao longo do tempo que diferencia as linhas celulares a partir de células primárias, alterando o fenótipo e função biológica da célula, incluindo as taxas de crescimento e as interacções com outras populações de células. As linhas celulares também não possuem os componentes normais do microambiente GI (epitelial, estromal, e componentes vasculares), que é uma limitação importante à sua utilização. Portanto, as conclusões da pesquisa linhagem celular experimental requer uma validação adicional para reduzir o risk de má interpretação.
Miofibroblastos primárias podem ser obtidas a partir de tecido de cólon humano e de ratinho para confirmar os resultados experimentais identificados em uma linha de células 7. O método foi descrito originalmente por Mahida et al. 8, e o nosso protocolo é uma das várias técnicas bem definidas que podem ser utilizadas para isolar os miofibroblastos primários de ratinho e de cólon humano 9. Para qualquer modelo do rato da doença colônica, esta técnica pode ser usada para isolar myofibroblasts principais para estudar a forma como eles interagem com as células vizinhas ou contribuir para tanto normal ou patológica GI processa 10,11. Esta técnica pode ser usada para estudar como miofibroblastos contribuir para a cicatrização da mucosa, fibrose, e o desenvolvimento de adenomas e carcinomas. Miofibroblastos primárias também pode ser obtido a partir de tecido de cólon humano que foi ressecado, no momento da operação de benigna (doença inflamatória do intestino, estenoses, diverticulite) ou maligno cCONDIÇÕES. As células primárias isoladas a partir de tecido de cólon humano e de ratinho podem ser cultivadas em cultura celular e utilizada ao longo de um número limitado de passagens.
Protocol
Representative Results
Discussion
A técnica geral é semelhante ao usar o mouse ou o cólon humano. Esta técnica também pode ser usada para isolar os miofibroblastos do intestino delgado. Detalhes específicos para o isolamento de miofibroblastos de 1. rato e 2. cólon humano são discutidos abaixo.
1. Rato Colon
Irrigação do cólon do rato é facilitada pela fixação de um 4 em 16 L Popper agulha de extremidades cegas para uma das extremidades do cólon. Isso também ajuda quando o corte do c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health Grant 5KO8DK085136-02 a JY.
Materials
Table of specific reagents and equipment:
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Dispase I | Invitrogen/GIBCO | #17105-041 | |
| Collagenase D | Roche | #1 088 858 | |
| 4 in, 16 G Popper blunt-end needle | Fisher | #14-825-16K |
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