Isolamento e Caratterizzazione chimica del lipide A da batteri Gram-negativi
Summary
Isolamento e caratterizzazione del lipide Un dominio di lipopolisaccaride (LPS) da batteri gram-negativi fornisce comprensione dei meccanismi cellulari di superficie a base di antibiotico-resistenza, la sopravvivenza dei batteri e fitness, e come chimicamente lipidi varia Una specie molecolari differenziale modulano la risposta immunitaria innata.
Abstract
Lipopolisaccaride (LPS) è il principale molecola di superficie cellulare di batteri gram-negativi, depositato sul foglietto esterno della membrana a doppio strato esterno. LPS possono essere suddivise in tre domini: l'O-distale polisaccaridi, oligosaccaridi un nucleo, e il lipide A dominio costituito da un lipide una specie molecolare e residui di acido 3-desossi-D-manno-ott-2-ulosonic (Kdo). Il dominio lipide A è l'unico componente essenziale per la sopravvivenza delle cellule batteriche. Dopo la sua sintesi, lipide A viene modificato chimicamente in risposta a stress ambientali come il pH o temperatura, per favorire la resistenza a composti antibiotici, e di eludere riconoscimento da mediatori della risposta immunitaria innata ospitante. Dettagli Il protocollo segue l'isolamento piccola e larga scala di lipide A da batteri gram-negativi. Isolato materiale viene poi caratterizzato chimicamente per cromatografia su strato sottile (TLC) o spettrometria di massa (MS). Oltre a matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione tempo di fluce (MALDI-TOF) MS, abbiamo anche descrivono i protocolli MS tandem per l'analisi dei lipidi Una specie molecolari utilizzando la ionizzazione electrospray (ESI) accoppiato a collisione indotta dissociazione (CID) e fotodissociazione ultravioletti neoassunto (UVPD) metodi. I nostri protocolli di MS consentono la determinazione inequivocabile della struttura chimica, di primaria importanza per la caratterizzazione di molecole di un lipide che contengono modifiche chimiche uniche o romanzo. Abbiamo anche descrivono l'etichettatura radioiso e successivo isolamento, di lipide A da cellule batteriche per l'analisi mediante TLC. Confrontate protocolli basati su MS, TLC fornisce un metodo di caratterizzazione più economico e rapido, ma non può essere utilizzata per assegnare inequivocabilmente lipide A strutture chimiche senza l'utilizzo di standard noti struttura chimica. Negli ultimi due decenni, l'isolamento e la caratterizzazione di lipide A ha portato a numerose scoperte emozionanti che hanno migliorato la nostra comprensione della fisiologia dei batteri gram-negativi, meccanismi di resistenza antibioticaza, la risposta immunitaria innata umana, e hanno fornito molti nuovi bersagli per lo sviluppo di composti antibatterici.
Introduction
Lipopolisaccaride (LPS) è il principale molecola superficie esterna di quasi tutti gli organismi gram-negativi e costituito da tre domini molecolari: un polisaccaride distale O-antigene, un oligosaccaride nucleo, e la lipidi associata alla membrana Un dominio depositato sul foglietto esterno della esterno membrana a doppio strato 1,2. Il lipide Un dominio è costituito da 3-deossi-D-manno-ottobre-2-ulosonic (Kdo) residui e un lipide una specie molecolare, dove lipide A può essere definita come la porzione solubile in cloroformio di LPS su idrolisi acida lieve-1, 2. Il lipide standard A molecola può essere chimicamente definito come un backbone diglucosamine che è esa-acilato e bis-fosforilato; coerente con le principali specie lipide A osservati nel modello organismo Escherichia coli (E. coli) 1,2. Nove geni espressi costitutivamente, conservati in tutta batteri gram-negativi, sono responsabili della produzione del lipide A dominio (Figura 1) 1,2. La maggior parte dei batteri hanno un ulteriore insieme di geni, che variano in grado di conservazione filogenetica, che partecipano ulteriore modificazione chimica del lipide A 3. Defosforilazione, rimozione di catene acile, e l'aggiunta di parti chimiche come zuccheri amminoacidi (es aminoarabinose) e / o fosfoetanolamina sono le attività più comunemente osservati (Figura 1). Molti degli enzimi responsabili lipide A modifica sono direttamente attivati da segnali ambientali, quali cationi bivalenti, o la loro espressione è regolata da due sistemi di reazione-regolatore dei componenti 3.
Riconoscimento di specie un lipide da parte del sistema immunitario innato ospite è mediato dal recettore Toll-like fattore di differenziazione 4/myeloid 2 (TLR4/MD2) co-recettore 4. Forze idrofobiche tra MD2 e il lipide A catene acile, nonché tra TLR4 e gruppi fosfato 1 e 4 'di lipide A promuovere la forte associazione di labbroid A con TLR4/MD2 4,5. Le modifiche che alterano stato acilazione o la carica negativa del lipide A lipidico basata impatto TLR4/MD2 Un riconoscimento e stimolazione a valle della risposta immunitaria innata attivatori NF-kB e mediatori dell'infiammazione come TNFa e IL1-β 6,7. Modifiche che mascherano la carica negativa del lipide A impediscono anche battericida peptidi antimicrobici cationici di legarsi al gram-negativi superficie delle cellule 3,8. Molte modifiche lipide A sono ipotizzati per aumentare la forma batterica in determinate condizioni ambientali, come all'interno dell'ospite umano o in una nicchia ecologica. Per questo motivo molti enzimi di modificazione sono obiettivi attraenti per lo sviluppo razionale di composti antimicrobici. La diversità chimica delle strutture un lipide, rispetto al microrganismo e / o l'ambiente, e le implicazioni biologiche di queste strutture diverse rendono la caratterizzazione strutturale di lipide A uno sforzo importante in tegli studio di batteri gram-negativi.
L'isolamento di una molecole lipidiche da batteri interi coinvolge l'estrazione di LPS dalla superficie della cellula batterica, una fase idrolitica per liberare lipide A, seguita da una procedura di purificazione finale 9-11. La procedura di estrazione più frequentemente citata LPS è la procedura di estrazione di acqua calda-fenolo, introdotto da Westphal e Jann 10. Dopo estrazione intero LPS è sottoposto ad idrolisi lieve-acido, che separa chimicamente Kdo dalla 6'-idrossile dello zucchero glucosamina distale del lipide A (Figura 1). Esistono numerose difficoltà per la procedura di acqua calda-fenolo compreso l'uso di un reagente alta pericolosità, la necessità di degradare acidi coestratti nucleici e proteine, e più giorni sono necessari per completare il protocollo 10.
Il nostro laboratorio ha ulteriormente sviluppato l'estrazione e l'isolamento di lipide A come primo sviluppato da Caroff e Raetz 12,13. Rispetto alle procedure acqua calda-fenolo, il metodo qui presentato è più rapida ed efficiente e ospita una vasta gamma di volumi di coltura da 5 ml a più litri. Inoltre, a differenza estrazioni acqua calda-fenolo, il nostro metodo non seleziona per-ruvide o lisce tipi di LPS, garantendo il recupero ottimale della specie A lipidiche. Nel nostro protocollo, lisi chimica delle cellule batteriche intere viene eseguita utilizzando una miscela di cloroformio, metanolo e acqua, dove LPS possono essere pellet per centrifugazione. Una combinazione di idrolisi lieve-acida e estrazioni solvente (Bligh-Dyer) vengono utilizzati per liberare lipide A da polisaccaride covalentemente. Il metodo di Bligh e Dyer è stato applicato prima alla estrazione di specie lipidiche da una varietà di animali e piante dei tessuti 14, modificato qui per separare polisaccaride idrolizzato dal lipide A. In questa fase di separazione finale, lipidi solubili cloroformio partizionare selettivamente nella organica inferiore fase. Per purificare ulteriormente lipide A, reverse-fase oanionico cromatografia su colonna di scambio può essere utilizzato 12.
Dopo l'isolamento del lipide A specie di cellule intere, un certo numero di metodi analitici possono essere utilizzati per caratterizzare la struttura chimica del materiale isolato come NMR, TLC, e analisi MS. NMR permette di non distruttivo delucidazione strutturale, e fornisce dettagli strutturali relativi a legami glucosidi, l'assegnazione inequivocabile delle posizioni catena acilica, e l'assegnazione dei siti di attacco per A modificazioni dei lipidi come aminoarabinose o fosfoetanolamina 15-17. Analisi NMR del lipide A non viene discusso all'interno del nostro protocollo, ma è stata descritta adeguatamente altrove 15,16. Per l'analisi rapida TLC basano metodi sono utilizzati di frequente, ma non riescono a fornire informazioni dirette riguardanti fine struttura chimica. Protocolli basati SM sono il metodo più frequentemente impiegato per caratterizzare le strutture un lipide 18,19. Matrice associata desorbimento laser ionizzazione (MALDI)-MS viene spesso utilizzato per rilevare inizialmente intatte specie lipidico A. Ioni Singolarmente cariche sono generati da analiti preparati secondo le nostre procedure di estrazione. Poiché è necessaria più fine analisi strutturale, metodi basati MS / MS rivelarsi più informativo di MALDI-MS. Abbinato a ionizzazione electrospray (ESI) lipidi carica singolarmente o moltiplicare A ioni precursori sono ulteriormente frammentati dalla collisione indotta dissociazione (CID) o fotodissociazione ultravioletta (UVPD), per generare ioni prodotto strutturalmente informativi 18,20,21. Prodotti per la perdita neutre lipide A ioni precursori sono anche spesso generate durante ESI-MS fornisce un ulteriore livello di informazioni strutturali.
Spettrometria di massa tandem (MS / MS) ha dimostrato di essere un metodo indispensabile e versatile per la delucidazione delle strutture un lipide. Durante MS / MS, ioni vengono attivati per produrre un pattern di frammentazione diagnostico che può essere utilizzata per delucidare la struttura dello ione precursore. Il più diffuso avaOTTIMIZZARE LE OPPORTUNITÀ metodo MS / MS è CID. Questo metodo produce frammenti di ioni attraverso collisioni dello ione precursore selezionato con un gas inerte bersaglio, con conseguente deposizione di energia che porta alla dissociazione. CID è dimostrato uno strumento fondamentale nell'assegnazione di una struttura lipidica per una vasta gamma di specie batteriche 22-33.
Sebbene CID è il metodo MS / MS più universalmente attuato, genera una matrice limitato di ioni prodotto. 193 nm UVPD è una alternativa e complementare metodo MS / MS. Questo metodo utilizza un laser per irradiare ioni, e l'assorbimento di fotoni provoca energizzazione degli ioni e la successiva dissociazione. Questa energia superiore tecnica MS / MS produce una gamma più diversificata di ioni prodotto di CID e quindi fornisce modelli più informativi frammentazione. In particolare, UVPD offre informazioni sui cambiamenti sottili nella specie un lipide sulla base delle spaccature a glicosidica, ammine, acile e CC obbligazioni legate 18,21,34.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo abbiamo dettagliato l'isolamento di lipidi Una specie di cellule intere di batteri, e descritto TLC o metodi analitici basati MS per caratterizzare chimicamente il materiale isolato. Spettrometria di massa tandem è una potente strategia per de novo caratterizzazione strutturale di composti biologici, ed è prezioso per la caratterizzazione chimica della panoplia di molecole di un lipide osservate in natura. CID e UVPD sono due metodi di attivazione complementari che creano diversi tipi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni AI064184 e AI76322 dal National Institutes of Health (NIH) e da Grant 61789-MA-MUR dalla ricerca dell'Ufficio dell'Esercito di MST La ricerca è stata sostenuta anche dalla Welch Foundation Grant F1155 e NIH concedere R01GM103655 a JSB
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | C607 | HPLC Grade |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | A452 | HPLC Grade |
| Teflon FEP Centrifuge Bottles | Thermo Fisher Scientific | 05-562-21 | |
| Silica Gel 60 TLC Plates | EMD Biosciences | 5626-6 | |
| Grade No. 3MM Chromatography Paper | Whatman | 3030700 | |
| Orbitrap Elite | Thermo Fisher Scientific | ||
| Mass Spectrometer | |||
| ExciStar XS Excimer Lasrer | Coherent Inc. | ||
| PicoTip Nanospray ESI emitters | New Obectives | ≥ 30 μm to reduce clogging | |
| Model 505 Pulse/Delay Generator | Berkeley Nucleonics Corporation | ||
| Hot Plate Thermoylne 2200 | Barnstead/Thermolyne | HPA2235MQ | |
| 16×125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes | Corning Pyrex | 99449-16X | |
| Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415 | Corning | 9999-152 | |
| Personal Molecular Imager System (phosphorimager) | BioRad | 170-9400 | |
| Autoradiography Cassette | Thermo Fisher Scientific | FBCS810 | |
| Phosphorscreen SO230 | Kodak | ||
| Peptide Mass Standards Kit | Sequazyme | P2-3143-00 | |
| Sonifier S250-A | Branson | 101063196 | |
| 1.5 ml 12×32 mm Tapered Base Screw Thread Vial | Thermo Fisher Scientific | C4000-V1 |
References
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