أجهزة الاستشعار التي تقيس Ratiometric الدولة الأكسدة الميتوكوندريا وATP في الخلايا الحية الخميرة

Summary

نحن تصف استخدام اثنين من ratiometric، أجهزة الاستشعار المشفرة وراثيا، والتي تقوم على GFP، لرصد الميتوكوندريا الدولة الأكسدة ومستويات ATP في قرار التحت خلوية في الخلايا الحية الخميرة.

Abstract

الميتوكوندريا لها أدوار في العديد من العمليات الخلوية، من استقلاب الطاقة والكالسيوم للسيطرة الخلوية العمر وموت الخلية المبرمج. تؤثر هذه العمليات وتتأثر حالة الأكسدة من إنتاج ATP وبواسطة الميتوكوندريا. هنا، نحن تصف استخدام اثنين من ratiometric، أجهزة الاستشعار المشفرة وراثيا التي يمكن الكشف عن الميتوكوندريا الدولة الأكسدة ومستويات ATP في قرار التحت خلوية في الخلايا الحية الخميرة. يتم قياس حالة الأكسدة الميتوكوندريا باستخدام حساسة الأكسدة بروتين الفلورية الخضراء (roGFP) التي يتم تستهدف المصفوفة الميتوكوندريا. ميتو-roGFP يحتوي cysteines في مناصب 147 و 204 من GFP، التي تخضع الأكسدة عكسها والتي تعتمد على البيئة والحد، والذي بدوره يغير من الطيف الإثارة من البروتين. MitGO-ATeam هو صدى نقل الطاقة فورستر (الحنق) التحقيق فيها الوحيدات ε من F _o غير محصورة F _1-ATP سينسيز بين الحنق المانحة ومتقبل FLUOالبروتينات rescent. ملزمة للاعبي التنس المحترفين لنتائج الوحيدات ε في التغييرات التشكل في البروتين التي تجلب الحنق المانحة ومتقبل في القرب والسماح للصدى مضان نقل الطاقة من الجهة المانحة إلى متقبل.

Introduction

الميتوكوندريا هي عضيات ضرورية لإنتاج ATP، الحيوي من الأحماض الأمينية، والأحماض الدهنية، الهيم، الحديد كتل الكبريت والبريميدينات. الميتوكوندريا أيضا أن تلعب دورا محوريا في الكالسيوم، وتنظيم موت الخلايا المبرمج. ¹ زيادة الروابط أدلة الميتوكوندريا إلى الشيخوخة، والمرتبط بالعمر الأمراض بما في ذلك مرض باركنسون ومرض الزهايمر والتصلب الوحشي الضموري، ومرض هنتنغتون. ² بينما الأفراد يعيشون حياتهم كلها مع الطفرات في الميتوكوندريا البروتينات التي ترتبط مع أمراض الاعصاب، تحدث أعراض المرض في وقت لاحق فقط في الحياة. وهذا يدل على أن التغيرات تحدث في الميتوكوندريا مع التقدم في السن التي تسمح علم الأمراض في الظهور. في الواقع، يرتبط ارتباطا واللياقة البدنية الميتوكوندريا مع الصحة العامة الخلية وعمر في الخميرة وخلايا الثدييات. ^3،4 هنا، نحن تصف كيفية استخدام ترميز وراثيا، أجهزة الاستشعار فلوري ratiometric لتقييم اثنين من الميزات الهامة من mitochondria في الخلايا الحية الخميرة: حالة الأكسدة ومستويات ATP.

راسخة وظيفة الميتوكوندريا في تعبئة الطاقة الهوائية. الدولة الأكسدة الميتوكوندريا هو نتاج للحد من والمؤكسدة الأنواع في عضية، بما في ذلك NAD ⁺ / NADH، FAD / القوات المسلحة الهايتية _2، NADP ⁺ / NADPH، الجلوتاثيون / الجلوتاثيون ثاني كبريتيد (GSH / GSSG) وأنواع الاكسجين التفاعلية (ROS). فك ربط الميتوكوندريا أو نقص الأكسجة يؤثر على نشاط الجهاز التنفسي الميتوكوندريا ويغير نسبة NAD ⁺ إلى NADH في عضية. ROS، التي يتم إنتاجها من نقل الإلكترون غير فعالة بين المجمعات من سلسلة نقل الإلكترون في غشاء الميتوكوندريا الداخلية، وكذلك من نزع الأمين الأمينات عبر أوكسيديز في غشاء الميتوكوندريا الخارجي ^5، ضرر الدهون، والبروتينات، والأحماض النووية ولها تم ربط الشيخوخة وأمراض الاعصاب المرتبط بالعمر ^6،7،8. ROS أيضا أن تلعب دورا في نقل الإشارة في مitochondria، من خلال أكسدة الجلوتاثيون. على سبيل المثال، NADH نازعة يساهم ليس فقط لإنتاج ROS ولكن أيضا وينظم من خلال التفاعل مع تجمع الجلوتاثيون ^9،10. نازعة α-كيتوغلوتارات وأكونيتاز، مكونات دورة TCA، تظهر انخفاض النشاط في بيئات المؤكسدة ^11،12.

في الواقع، يتم حفظها التنظيم التي تعتمد على الأكسدة والاختزال من النشاط أكونيتاز من البكتيريا إلى الثدييات ^13،14. وبالتالي، رصد حالة الأكسدة ومستويات ATP من الميتوكوندريا أمر حاسم لفهم وظيفتها ودورها في علم الأمراض.

وقد استخدمت أساليب الكيمياء الحيوية لتقييم حالة الأكسدة أو مستويات ATP من الخلايا بأكملها أو عزل الميتوكوندريا. والأساليب المستخدمة على نطاق واسع لتقييم حالة الأكسدة من الخلايا بأكملها أو بناء معزول الميتوكوندريا على قياس مستويات الزوج الأكسدة GSH / GSSG ^15. يتم استخدام نظام وسيفيرين-وسيفيراز عادة لقياس الميتوكوندريامستويات ATP في الخلايا إما كاملة أو permeabilized معزولة الميتوكوندريا. ^{16،17،18،19،20} في هذا الاختبار، وسيفيراز بربط ATP ويحفز أكسدة والتوهج من وسيفيرين ²¹ لشدة الضوء المنبعث يتناسب مع كمية من ATP في خليط التفاعل. ²²

وقد كشفت هذه الأساليب المعلومات الأساسية بشأن وظيفة الميتوكوندريا، بما في ذلك وجدت أن المرضى الذين يعانون من الأمراض العصبية، مثل مرض الزهايمر، لديهم انخفاض غير عادي في مستويات ATP. ²³ ومع ذلك، فإنها لا يمكن أن تستخدم لصورة حية، خلايا سليمة. وعلاوة على ذلك، على أساس أساليب تحليل كامل الخلية توفير ما معدله حالة الأكسدة أو مستويات ATP في جميع مقصورات للخلية. القياسات في العضيات معزولة يمكن أن تكون إشكالية لأن الدولة الأكسدة الميتوكوندريا أو مستويات ATP قد تتغير خلال تجزيء التحت خلوية. وأخيرا، فإن الدراسات الحديثة من مختبرنا وغيرها تشير إلى أنالميتوكوندريا في الخلايا الفردية غير متجانسة في وظيفة، وهذا بدوره يؤثر على عمر الخلايا الأم وابنتها. ³ وهكذا، هناك حاجة لقياس مستويات ATP الميتوكوندريا والدولة الأكسدة والاختزال في الخلايا الحية لقرار التحت خلوية.

وأجهزة الاستشعار من أجل وظيفة الميتوكوندريا وصفها هنا على حد سواء على أساس GFP. GFP حساسة الأكسدة (roGFP) ^24،25 هو البديل GFP تضاف فيها cysteines المعرضة لسطح الجزيء. roGFP، مثل البرية من نوع GFP، واثنين من قمم الإثارة (في ~ 400 نانومتر و 480 نانومتر ~) وذروة الانبعاثات واحد في ~ 510 نانومتر. أكسدة بقايا السيستين في نتائج roGFP في زيادة الإثارة في 400 نانومتر ~. الحد من تلك cysteines تفضل الإثارة في 480 نانومتر ~. وهكذا، فإن نسبة الانبعاثات من 510 نانومتر على إثارة roGFP في 480 نانومتر و 400 نانومتر يكشف عن مبلغ قريب من خفض وتتأكسد roGFP، الذي يعكس حالة الأكسدة بيئة fluorophore لل.

اثنين من قيود التصدير الطوعيةوتستخدم على نطاق واسع من الأيونات roGFP: roGFP1 وroGFP2. كلاهما يحتوي على نفس الإدراج السيستين. ويستند roGFP1 على النوع البري GFP، ويستند roGFP2 على S65T GFP، التي لديها الإثارة أكثر كفاءة في 480 نانومتر والإثارة أقل كفاءة في 400 نانومتر مقارنة wtGFP ^24. roGFP1 هو أقل درجة الحموضة حساسية من roGFP2 ومجموعة ديناميكية تمتد الى مزيد من نطاق مخفض. وبالتالي، قد يكون أكثر فائدة roGFP1 لرصد أكثر الحد من المقصورات مثل الميتوكوندريا أو العصارة الخلوية، ومقصورات درجة الحموضة مع المتغير، مثل الإندوسومات. يقدم roGFP2 إشارة أكثر إشراقا، وفي بعض الدراسات، مجموعة ديناميكية أكبر من roGFP1 ^24،26. وتشير الدراسات في thaliana نبات الأرابيدوبسيس أن الوقت اللازم للاستجابة للتغيرات في حالة الأكسدة مشابه لكلا أجهزة الاستشعار (T ½ لأكسدة و 65 و 95 ثانية و t ½ للحد من، 272 و 206 ثانية، لroGFP1 وroGFP2، على التوالي). ²⁶

MitGO-ATeam2 هو الغازية الحد الأدنى، يمكن الاعتماد عليهاأجهزة الاستشعار التي تقيس الميتوكوندريا ATP في خميرة خميرة الخباز في مهدها. GO-ATeam هو صدى نقل الطاقة فورستر (الحنق) التحقيق التي تتكون من الوحيدات ε من F _س F _1-ATP سينسيز تقع بين الحنق المانحة والبروتينات الفلورية متقبل (GFP والبرتقالي بروتين فلوري (OFP)، على التوالي). ²⁷ ملزمة للاعبي التنس المحترفين لنتائج الوحيدات ε في التغييرات متعلق بتكوين في البروتين التي تجلب الحنق المانحة في مقربة من متقبل والسماح لنقل الطاقة من المانحين لالمتقبلة. هناك نوعين مختلفين من GO-ATeam، GO-GO-ATeam1 وATeam2. GO-ATeam2 لها قابلية أعلى للMgATP من GO-ATeam1، مما يجعلها أكثر ملاءمة لقياس أقل عادة [ATP] في الميتوكوندريا مقارنة مع العصارة الخلوية. ²⁷

لبحث حالة الأكسدة الميتوكوندريا، اقمنا بروتين الانصهار (ميتو-roGFP1)، ويتألف من roGFP1 تنصهر لتسلسل زعيم ATP9 علىوأعرب الثانية من القائم السنترومير (منخفض في عدد النسخ) تعبير البلازميد الخميرة تحت السيطرة من نازعة غليسيرألدهيد-3-الفوسفات قوية (GPD) المروج (p416GPD، Addgene). كنا roGFP1 للتحقيق في حالة الأكسدة من الميتوكوندريا في سياق الشيخوخة من طراز فطر خميرة الخباز. نجد أن roGFP1 يمكن الكشف عن التغييرات في حالة الأكسدة الميتوكوندريا التي تحدث أثناء الشيخوخة وردا على توافر المواد الغذائية ولكن ليس له تأثير ضار واضح على خلايا الخميرة. نحن أيضا نرى تقلب في ولاية الأكسدة من الميتوكوندريا في خلايا الخميرة الحية الفردية، وهو الاكتشاف الذي يؤكد على أهمية وجود جهاز الاستشعار البيولوجي مع القرار المكانية التحت خلوية.

MitGO-ATeam2 هو البديل من GO-ATeam2، والتي لديها تسلسل إشارة الميتوكوندريا من السيتوكروم أوكسيديز ج VIIIA الوحيدات إدراجها في محطة الأمينية من GO-ATeam2 ²⁷ نحن تعديل مسبار mitGO-ATeam2 (شريطة تتكرم من قبل المختبر من H. نوجي، معهد Oجمعة البحوث العلمية والصناعية، جامعة أوساكا، اليابان) لاستخدامها في الخميرة التي subcloning ذلك، عبر Xba1 ومواقع HindIII، في الخميرة التعبير ناقلات pAG415GPD-ccdB (Addgene، كامبريدج، MA، الولايات المتحدة الأمريكية)، وهو الاسعار المنخفضة للنسخة البلازميد يحتوي على التأسيسي GPD المروج قوية. عبرنا عن mitGO-ATeam2 في الخميرة في مهدها، وتجد، من خلال counterstaining مع الحمض النووي ملزم صبغ دابي، أنه يموضع حصرا لالميتوكوندريا، حيث أنه بمثابة مسبار فعالة لقياس التغيرات الفسيولوجية في مستويات ATP الميتوكوندريا.

roGFP وGO-ATeam على حد سواء المشفرة وراثيا. ونتيجة لذلك، فإنها يمكن إدخال وصيانة ثابت في خلايا سليمة، وتقديم معلومات عن حالة الأكسدة أو مستويات ATP في الفردية، الخلايا الحية. وعلاوة على ذلك، على حد سواء أجهزة الاستشعار مراقبة التغيرات في حالة الأكسدة أو مستويات ATP التي تحدث في ظل الظروف الفسيولوجية ²⁸ المركبتان هي أيضا ratiometric. ونتيجة لذلك، لا تتأثر القياسات التي أجريت مع هذه التحقيقات من قبل تشاnges في تركيز جهاز الاستشعار البيولوجي أو عينة إضاءة أو سمك. وأخيرا، تقديم كل من أجهزة الاستشعار القرار المكانية التحت خلوية. وبالفعل، فقد تم استهداف roGFP إلى الميتوكوندريا، ER، الإندوسومات وperoxisomes ^24، ويمكن الكشف عن التغييرات في حالة الأكسدة لكل من هذه العضيات، مستقلة إلى حد كبير من الحموضة.

Protocol

1. التحول من خلايا الخميرة مع أجهزة الاستشعار تحويل سلالة الخميرة المطلوب مع البلازميد تحمل ميتو-roGFP أو mitGO-ATeam2 باستخدام طريقة خلات ليثيوم 27. لتأكيد التحول مع جهاز الاستشعار البيولوجي ?…

Representative Results

قياس حالة الأكسدة الميتوكوندريا مع ميتو-roGFP هنا، وتبين لنا أن ميتو-roGFP1 لديه مجموعة ديناميكية للكشف عن تغيرات في حالة الأكسدة الميتوكوندريا من تتأكسد تماما إلى انخفاض في الخلايا الحية الخميرة، دون أن يؤثر نمو الخلايا الخميرة أو ال?…

Discussion

هنا، نحن تصف أساليب لاستخدام ميتو-roGFP1 وmitGO-ATeam2 كما أجهزة الاستشعار لتقييم الميتوكوندريا الدولة الأكسدة ومستويات ATP في الخلايا الحية الخميرة. نجد أن التعبير التي تنقلها البلازميد ميتو-roGFP1 أو mitGO-ATeam النتائج في كمية استهداف الميتوكوندريا، دون أي تأثير واضح على التشكل ا…

Materials

			Reagents
Antimycin A	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	1397-94-0	Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.
SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glycerol 0.05% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
Valap			Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin
			Equipment and Software
Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides	Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)	3050	Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm
High-performance coverslips, No. 1.5, 18×18 mm	Zeiss (Thornwood, NY)	474030-9000-000	These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance
Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)	12-545E	Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm)
A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective	Nikon (Melville, NY)
AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software	Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)
Volocity 3D Image Analysis software	Perkin Elmer (Waltham, MA)		Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement
ImageJ software	National Institutes of Health (Bethesda, MD)		http://rsb.info.nih.gov/ij/