リビング酵母細胞におけるミトコンドリア酸化還元状態とATPを測定レシオメトリックバイオセンサー

Summary

我々は、生きた酵母細胞における細胞内解像度でミトコンドリアの酸化還元状態およびATPレベルを監視するために、GFPをもとにしている2つのレシオメトリック、遺伝的にエンコードされたバイオセンサの使用が記載されている。

Abstract

ミトコンドリアはエネルギー代謝や細胞の寿命とプログラム細胞死を制御するカルシウムの恒常性から、多くの細胞プロセスで役割を持っている。これらのプロセスには影響を与え、ミトコンドリアでの酸化還元状態とATP産生の影響を受けている。ここでは、酵母細胞を生きた細胞内での解像度でミトコンドリアの酸化還元状態およびATPレベルを検出できる2つのレシオメトリック、遺伝的にエンコードされたバイオセンサの使用を記載している。ミトコンドリアの酸化還元状態は、ミトコンドリアマトリックスを標的とレドックス感受性緑色蛍光タンパク質（roGFP）を用いて測定される。水戸roGFPは、順番に、タンパク質の励起スペクトルを変えるリバーシブルと環境依存の酸化還元を受ける位置が147とGFPの204でシステインを含んでいます。 MitGO-ATeam F _O F _1-ATPシンターゼのεサブユニットとの間に挟まれたフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）プローブはドナー及びアクセプター蛍光のFRETされているrescentタンパク質。もたらすタンパク質における立体構造変化εサブユニット結果にATPの結合は近接ドナーとアクセプターとのFRETドナーからアクセプターへの蛍光共鳴エネルギー移動を可能にする。

Introduction

ミトコンドリアは、アミノ酸、脂肪酸、ヘム鉄硫黄クラスターおよびピリミジンのATP産生合成に必須の細胞小器官である。ミトコンドリアはまた、カルシウムの恒常性において重要な役割を果たしている、とアポトーシスの制御インチパーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、およびハンチントン病を含む老化や加齢に伴う疾患にミトコンドリア¹増やす証拠リンクしています^。2個人がで彼らの全体の生活をしながら神経変性疾患に関連付けられているミトコンドリアタンパク質の変異は、病気の症状だけでその後の人生で起こる。これは、その変化が出現する疾患は病理許す年齢とともにミトコンドリアで発生することを示します。確かに、ミトコンドリアの適性が全体細胞の健康と寿命酵母および哺乳類細胞と相関している。ここ^3,4、我々はmitocの2つの重要な機能を評価するために、遺伝的にコード化され、レシオメトリック蛍光バイオセンサーを使用する方法について説明します酵母細胞を生体内でhondria：レドックス状態とATPレベル。

有酸素エネルギー動員におけるミトコンドリア機能が十分に確立されている。ミトコンドリアの酸化還元状態は、NAD ⁺ / NADH、FAD / FADH _2、NADP ⁺ / NADPH、グルタチオン/グルタチオンジスルフィド（GSH / GSSG）と活性酸素種（ROS）を含む、オルガネラの種を還元し、酸化生成物である。ミトコンドリアまたは低酸素脱共役するミトコンドリア呼吸活性に影響を及ぼすとオルガネラにNADHにNAD ⁺の比率を変更します。ミトコンドリア内膜における電子伝達鎖の複合体との間の非効率的な電子移動から、並びにミトコンドリア外膜^5、破損脂質、タンパク質、および核酸におけるモノアミンオキシダーゼを介してアミンの脱アミノ化から製造し有するROS、 ^6,7,8老化や加齢に伴う神経変性疾患にリンクされて。 ROSはまたメートルのシグナル伝達に関与するitochondria、GSHの酸化による。例えば、NADHデヒドロゲナーゼは、ROS産生に寄与するだけでなく、グルタチオンプール^9,10との相互作用を介して調節される。 α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼとアコニターゼ、TCAサイクルのコンポーネントは、環境の^11,12を酸化で還元活性を示す。

実際、アコニターゼ活性のレドックス依存性調節は、細菌から哺乳類^13,14に保存されている。したがって、酸化還元状態とミトコンドリアのATP濃度を監視することは、疾患の病理にその機能と役割を理解する上で重要です。

生化学的方法は、酸化還元状態又は全細胞または単離されたミトコンドリアのATPレベルを評価するために使用されている。全細胞やミトコンドリア孤立の酸化還元状態を評価するため、広く用いられている方法は、酸化還元対GSH / GSSG ¹⁵のレベルを測定することに基づいています。ルシフェリン – ルシフェラーゼ系は、一般に、ミトコンドリア測定するために使用されるミトコンドリア膜透過し、全細胞又は単離されたいずれかATPレベル^{。16,17,18,19,20}このアッセイにおいて、ルシフェラーゼ量に比例するATPに結合し、ルシフェリンの酸化の化学発光を触媒する^。21の出射光の強度反応混合物中の^ATP。22の

これらの方法は、アルツハイマー病などの神経変性疾患を有する患者は、異常に低いATPレベルを有するという発見を含むミトコンドリア機能に関する基本的な情報を明らかにした^{。23しかし} 、それらは画像の生活に使用されることができない、無傷の細胞。また、全細胞分析に基づく方法は、セルのすべてのコンパートメント内レドックス状態またはATPレベルの平均を提供する。ミトコンドリアの酸化還元状態やATPレベルは細胞下分画中に変更される可能性があるため孤立した小器官での測定は、潜在的に問題がある。最後に、我々の研究室等からの最近の研究では、ことを示している個々の細胞内のミトコンドリアが交互に母と娘細胞の寿命に影響を与える機能、不均質であるので^、3つの細胞内解像度を有する生細胞におけるミトコンドリアATPレベルおよび酸化還元状態を測定する必要がある。

ここで説明するミトコンドリア機能のためのバイオセンサーは、両方のGFPに基づいています。レドックス感受性^{GFP（roGFP）24,25は、}表面露出システインが分子に付加されたGFP変異体である。 roGFPは、野生型GFPのように、2つの励起ピーク（〜400 nmおよび480 nmで〜）および〜510nmで少なくとも一つの発光ピークを有する。 〜400 nmでの励起の増加roGFP結果中のシステイン残基の酸化。それらのシステインの減少は〜480 nmで励起を好む。これにより、480 nmおよび400 nmでの励起roGFP 510nmでの発光の比率は、フルオロフォアの環境の酸化還元状態を反映低減および酸化roGFPの相対量を明らかにする。

二つVERSroGFPのイオンが広く使用されています：roGFP1とroGFP2。どちらも同じシステインの挿入が含まれています。 roGFP1は、野生型GFPに基づいており、roGFP2はwtGFP ²⁴に比べて400 nmで480 nmでのより効率的な励起の少ない効率的な励起を持っS65T GFP、に基づいています。 roGFP1はroGFP2とそのダイナミックレンジが減少の範囲にさらに拡張するよりも敏感な小さいpHである。したがって、roGFP1は以上の還元などのミトコンドリアなどの区分や細胞質ゾル、そのようなエンドソームなどの変数のpHとコンパートメントを監視するためのより便利かもしれません。 roGFP2が明るく信号と、いくつかの研究で、roGFP1 ^24,26よりも大きなダイナミック·レンジを提供しています。 シロイヌナズナにおける研究では、酸化還元状態の変化に対応するために必要な時間は、両方のセンサ（T½酸化のために、65と95秒とt½それぞれroGFP1とroGFP2ための削減、272および206秒、など）についても同様であることを示している^。26

MitGO-ATeam2は、信頼性、低侵襲である出芽酵母サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）でミトコンドリアのATPを測定するセンサ。 GO-ATeamは、ドナーとアクセプター蛍光タンパク質（GFPおよびオレンジ（OFP）蛍光タンパク質をそれぞれ）FRET F _{プレーヤー}の間に挟まれたF _1-ATPシンターゼのεサブユニットから構成されるフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）プローブである^。27アクセプターの近くにドナーをFRETドナーからアクセプターへのエネルギー伝達を可能にさせるタンパク質の立体構造変化におけるεサブユニット結果にATPの結合。 GO-ATeam、GO-ATeam1とGO-ATeam2の二つの変種があります。 GO-ATeam2は、ミトコンドリア内で細胞質ゾルに比べて一般的に低い[ATP]を測定するための、それがより適切な意思、GO-ATeam1よりMgATPに対して高い親和性を持っています²⁷

ミトコンドリアの酸化還元状態を調べるために、我々はATP9リーダー配列に融合roGFP1からなる融合タンパク質（水戸roGFP1）を構築しndは強いグリセルアルデヒド-3 – リン酸デヒドロゲナーゼ（GPD）プロモーター（p416GPD、Addgene）の制御下でプラスミドセントロメア系（低コピー数）酵母発現から発現。我々はモデル菌サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の老化の文脈でミトコンドリアの酸化還元状態を調べるためにroGFP1を使用していました。我々はroGFP1、老化中および栄養可用性に応じて発生するが、酵母細胞には明らかな有害な影響を及ぼさないミトコンドリアの酸化還元状態の変化を検出できることがわかります。また、個々の生きている酵母細胞内のミトコンドリアの酸化還元状態の変動、細胞内の空間分解能でバイオセンサーの重要性を強調している知見を参照してください。

MitGO-ATeam2はGO-ATeam2のアミノ末端に挿入シトクロムcオキシダーゼサブユニットVIIIAのミトコンドリアシグナル配列を持つGO-ATeam2の変種です^。27私たちは、親切にHの研究室が提供するmitGO-ATeam2プローブ（修正野地研究所Oプラスミド低コピーである酵母発現ベクターpAG415GPD-CCDB（Addgene、ケンブリッジ、MA、USA）にXba1とHindIII部位を経由して、それをサブクローニングすることにより酵母で使用するためのfの科学産業研究、大阪大学、日本）、強力な構成GPDプロモーターを含む。私たちは、出芽酵母でmitGO-ATeam2を表明し、それがミトコンドリアのATPレベルの生理的変化を測定するための効果的なプローブとして機能し、それがミトコンドリアに排他的に局在し、DNA結合色素DAPI、、との対比により、見つける。

roGFPとGO-ATeamは、遺伝的にコードされている両方。結果として、それらが導入され、安定的に維持無傷の細胞において、酸化還元状態または個々の、生細胞内ATPレベルに関する情報を提供することができる。さらに、両方のバイオセンサーは、酸化還元状態や生理的条件下で発生するATPレベルの変化を監視します²⁸両プローブもレシオメトリックである。その結果、これらのプローブを使用した測定は、茶の影響を受けませんバイオセンサー濃度またはサンプル照明や厚さNGES。最後に、両方のバイオセンサーは、細胞内の空間分解能を提供します。実際、roGFPはミトコンドリア、小胞体に標的化された、エンドソームと²⁴ペルオキシソーム、およびpHの大部分は独立したこれらの細胞小器官のそれぞれの酸化還元状態の変化を検出することができる。

Protocol

1。バイオセンサーと酵母細胞の形質転換酢酸リチウム法27を用いたプラスミドベアリング水戸roGFPまたはmitGO-ATeam2で希望の酵母株を変換します。 プラスミド媒介バイオセンサーとの変換を確認するために、プラスミドの損失を防ぐために、選択し、適切な選択的な合成完全培地（水戸roGFP用SC-浦、またはmitGo-ATeam2用SC-レイ）で形質転換体を維持します。蛍光プローブは?…

Representative Results

水戸roGFPとミトコンドリアの酸化還元状態を測定ここでは、ミト-roGFP1は、酵母細胞増殖またはミトコンドリアの形態に影響を与えることなく、生きた酵母細胞を低減するために完全に酸化からミトコンドリアの酸化還元状態の変化を検出するためにダイナミックレンジを有することを示す。まず、ミトコンドリアを標的とGFPとroGFP1を発現する細胞は、通常料金（ 図1A?…

Discussion

ここでは、酵母細胞を生体内でミトコンドリアの酸化還元状態とATPのレベルを評価するためのバイオセンサーとして水戸roGFP1とmitGO-ATeam2を使用する方法について説明します。私たちは、定量的なミトコンドリアの形態や分布や細胞の成長率に明らかな影響を与えることなく、ミトコンドリアを標的にプラスミド媒介水戸roGFP1またはmitGO-ATeam結果の発現を見つける^。3水戸roGFP1は高度か?…

Materials

			Reagents
Antimycin A	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	1397-94-0	Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.
SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glycerol 0.05% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
Valap			Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin
			Equipment and Software
Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides	Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)	3050	Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm
High-performance coverslips, No. 1.5, 18×18 mm	Zeiss (Thornwood, NY)	474030-9000-000	These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance
Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)	12-545E	Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm)
A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective	Nikon (Melville, NY)
AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software	Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)
Volocity 3D Image Analysis software	Perkin Elmer (Waltham, MA)		Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement
ImageJ software	National Institutes of Health (Bethesda, MD)		http://rsb.info.nih.gov/ij/