Ratiometric Biosensors, dass die mitochondriale Redox Staats-und ATP in lebenden Hefezellen Messen

Summary

Wir beschreiben die Verwendung von zwei ratiometrischen, genetisch kodierte Biosensoren, die auf GFP basieren, zu mitochondrialen Redox-Zustand und ATP-Spiegel in subzellulären Auflösung in lebenden Hefezellen überwachen.

Abstract

Mitochondrien haben Rollen in vielen zellulären Prozessen, von Energiestoffwechsel und Calcium-Homöostase auf zellulärer Lebensdauer und den programmierten Zelltod steuern. Diese Vorgänge beeinflussen und werden durch die Redox-Status und die ATP-Produktion durch Mitochondrien beeinträchtigt. Hier beschreiben wir die Verwendung von zwei ratiometrischen, genetisch kodierte Biosensoren, die mitochondrialen Redox-Zustand und ATP-Spiegel in subzellulären Auflösung erkennen in lebenden Hefezellen können. Mitochondrialen Redox-Zustand wird unter Verwendung von Redox-sensitive Green Fluorescent Protein (roGFP), die an der mitochondrialen Matrix ausgerichtet ist. Mito-roGFP enthält Cysteine ​​an den Positionen 147 und 204 der GFP, die reversibel und umwelt-abhängige Oxidation und Reduktion, die wiederum verändern das Anregungsspektrum des Proteins unterzogen. MitGO-ATeam ist ein Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-Sonde, in dem der ε-Untereinheit des F _o F _{1-ATP-Synthase} eingeklemmt zwischen FRET-Donor und Akzeptor fluozierenden Proteinen. Die Bindung von ATP an die ε-Untereinheit führt zu Konformationsänderungen im Protein, die bringen FRET-Donor und Akzeptor in unmittelbarer Nähe und ermöglichen Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer vom Spender zum Akzeptor.

Introduction

Mitochondrien sind Organellen wichtig für die ATP-Produktion, Biosynthese von Aminosäuren, Fettsäuren, Häm, Eisen-Schwefel-Clustern und Pyrimidine. Mitochondrien spielen auch eine entscheidende Rolle bei Calcium-Homöostase, und in der Regulation der Apoptose. ¹ Zunehmende Anzeichen Links Mitochondrien Altern und altersbedingte Krankheiten wie Parkinson, Alzheimer, Amyotrophe Lateralsklerose und Huntington-Krankheit. ² Während Einzelpersonen ihr ganzes Leben leben Mutationen in mitochondrialer Proteine, die mit neurodegenerativen Erkrankungen assoziiert sind, treten die Krankheitssymptome erst im späteren Leben. Dies deutet darauf hin, dass Veränderungen in den Mitochondrien mit zunehmendem Alter, die Krankheit Pathologie entstehen lassen. Tatsächlich mitochondrialen Fitness mit insgesamt Zelle Gesundheit und Lebensdauer in Hefe-und Säugerzellen korreliert ist. ^3,4 Hier beschreiben wir, wie man genetisch kodierten, ratiometrischen Fluoreszenzbiosensoren verwenden, um zwei kritische Merkmale Mitoc beurteilenhondria in lebenden Hefezellen: Redox-Zustand und ATP-Spiegel.

Funktion der Mitochondrien bei der aeroben Energie Mobilisierung ist gut etabliert. Mitochondrialen Redox-Zustand ist ein Produkt der reduzierenden und oxidierenden Spezies in der Organelle, wie NAD ⁺ / NADH, FAD / FADH _2, NADP ⁺ / NADPH, Glutathion / Glutathion-disulfid (GSH / GSSG) und reaktive Sauerstoffspezies (ROS). Uncoupling Mitochondrien oder Hypoxie beeinflusst mitochondrialen Atmungskette Aktivität und verändert das Verhältnis von NAD ⁺ zu NADH in der Organellen. ROS, die durch ineffiziente Elektronentransfer zwischen Komplexe der Atmungskette in der inneren mitochondrialen Membran, sowie von der Desaminierung von Aminen über Monoaminoxidase in der äußeren mitochondrialen Membran ⁵ Schaden Lipide, Proteine ​​und Nukleinsäuren hergestellt werden und wurde zum Altern und altersbedingte neurodegenerative Erkrankungen ^6,7,8 verknüpft. ROS spielen auch eine Rolle bei der Signaltransduktion in mitochondria, durch Oxidation von GSH. Zum Beispiel, NADH-Dehydrogenase trägt nicht nur zur ROS-Produktion, sondern auch durch Wechselwirkungen mit der Glutathion-Pool ^9,10 geregelt. α-Ketoglutarat-Dehydrogenase und Aconitase, Komponenten des TCA-Zyklus, zeigen reduzierte Aktivität in oxidierenden Umgebungen ^11,12.

Tatsächlich ist Redox-abhängige Regulation der Aconitaseaktivität von Bakterien bis zu Säugetieren ^13,14 konserviert. So, die Überwachung der Redox-Zustand und ATP-Konzentrationen von Mitochondrien ist entscheidend für das Verständnis ihrer Funktion und Rolle in Pathologie.

Biochemische Methoden wurden verwendet, um das Redox-Zustand oder ATP-Spiegel von ganzen Zellen oder isolierten Mitochondrien beurteilen. Weit verbreitet Methoden, um die Redox-Zustand von ganzen Zellen oder beurteilen isolierten Mitochondrien sind auf der Messung der Werte des Redoxpaares GSH / GSSG ¹⁵ basiert. Das Luciferin-Luciferase-System wird häufig verwendet, um zu messen mitochondrialenATP-Spiegel entweder in permeabilisierten ganzen Zellen oder isolierten Mitochondrien. ^{16,17,18,19,20} In diesem Assay bindet Luciferase und ATP katalysiert die Oxidation von Luciferin und Chemilumineszenz. ²¹ die Intensität des emittierten Lichts ist proportional zu der Menge von ATP in der Reaktionsmischung. ²²

Diese Methoden wurden grundlegende Informationen zur mitochondrialen Funktion, einschließlich der Feststellung, dass Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen, wie Alzheimer-Krankheit, abnormal niedrigen ATP-Spiegel haben gezeigt. ²³ sie jedoch nicht verwendet werden, um Aufnahmen von lebenden, intakten Zellen werden. Darüber hinaus bieten Methoden Ganzzell-Analyse einen Durchschnitt von Redox-Zustand oder ATP-Spiegel in allen Kammern der Zelle. Messungen in isolierten Organellen sind potentiell problematisch, weil mitochondrialen Redox-Zustand oder ATP-Spiegel während der subzellulären Fraktionierung ändern kann. Schließlich zeigen neuere Studien aus unserem Labor und andere, dieMitochondrien innerhalb der einzelnen Zellen sind in ihrer Funktion heterogen, was sich wiederum auf die Lebensdauer von Mutter und Tochter-Zellen. ³ So gibt es eine Notwendigkeit, mitochondriale ATP-Spiegel und Redox-Status in lebenden Zellen mit subzellulären Auflösung zu messen.

Die Biosensoren für die Funktion der Mitochondrien hier beschrieben werden sowohl auf Basis von GFP. Redox-sensitive GFP (roGFP) ^24,25 ist eine GFP-Variante, in der Oberflächen-exponierten Cysteine ​​an das Molekül angefügt werden. roGFP wie Wildtyp-GFP, zwei Anregung Peaks (bei ~ 400 nm und ~ 480 nm) und ein Emissionsmaximum bei ca. 510 nm liegt. Oxidation der Cysteinreste in roGFP führt zu einer Erhöhung der Erregung bei ~ 400 nm. Reduction dieser Cysteine ​​begünstigt Anregung bei ~ 480 nm. Somit zeigt das Verhältnis von 510 nm Emission bei Anregung roGFP bei 480 nm und 400 nm die relative Menge von reduziertem und oxidiertem roGFP, die die Redox-Zustand des Fluorophors der Umgebung reflektiert.

Zwei versIonen roGFP sind weit verbreitet: roGFP1 und roGFP2. Sowohl die gleichen Cystein Insertionen. roGFP1 auf Wildtyp-GFP und roGFP2 basierend auf S65T-GFP, die eine effizientere Anregung bei 480 nm hat und weniger effiziente Anregung bei 400 nm im Vergleich zu wtGFP ²⁴ basiert. roGFP1 ist weniger empfindlich als pH roGFP2 und seine Dynamikbereich erstreckt sich weiter in die reduzierte Reichweite. So kann roGFP1 mehr nützlich für die Überwachung stärker reduzierenden Kompartimente wie Mitochondrien oder das Cytosol und Fächer mit variablen pH-Wert, wie Endosomen. roGFP2 bietet heller Signal und, in einigen Studien eine größere Dynamik als roGFP1 ^24,26. Studies in Arabidopsis thaliana zeigen, dass die Zeit für das Ansprechen auf Änderungen in Redox-Zustand erforderlich ist ähnlich für beide Sensoren (t ½ für die Oxidation, 65 und 95 sec und t ½ für die Reduktion, 272 und 206 sec für roGFP1 und roGFP2 bezeichnet) ist. ²⁶

MitGO-ATeam2 ist eine minimal-invasive, sichereSensor, der mitochondrialen ATP-Maßnahmen in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae. GO-ATeam ist ein Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-Sonde, die der ε-Untereinheit des F _o F _{1-ATP-Synthase} besteht die zwischen FRET-Donor und Akzeptor fluoreszierende Proteine ​​(GFP und orange fluoreszierenden Protein (OFP), respectively). ²⁷ Bindung von ATP an der ε-Untereinheit führt zu Konformationsänderungen in dem Protein, das die FRET-Donor bringen in enger Nähe zu dem Akzeptor und damit für Energieübertragung vom Donator zum Akzeptor. Es gibt zwei Varianten von GO-ATeam, GO-GO-ATeam1 und ATeam2. GO-ATeam2 hat eine höhere Affinität für MgATP als GO-ATeam1, so dass es für die Messung der in der Regel niedriger [ATP] in den Mitochondrien im Vergleich zum Cytosol. ²⁷

Um mitochondrialen Redox-Zustand untersuchen, konstruierten wir ein Fusionsprotein (mito-roGFP1), bestehend aus roGFP1 fusioniert mit dem ATP9 Leader-Sequenz einnd ausgedrückt aus einer Zentromer-basierte (low copy number) Hefe-Expressionsplasmid unter Kontrolle des starken Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GPD) Promotor (p416GPD, Addgene). Wir verwendeten roGFP1 die Redox-Status von Mitochondrien in zunehmender Alterung des Modells Pilz Saccharomyces cerevisiae sondieren. Wir finden, dass roGFP1 können Veränderungen in der mitochondrialen Redox-Zustand, während des Alterns und in Reaktion auf die Verfügbarkeit von Nährstoffen auftreten, aber keinen offensichtlichen nachteiligen Effekt auf die Hefe-Zellen zu detektieren. Wir sehen auch, Variabilität in der Redox-Zustand der Mitochondrien innerhalb der einzelnen lebenden Hefezellen, ein Befund, der die Bedeutung eines Biosensors mit subzelluläre räumliche Auflösung unterstreicht.

MitGO-ATeam2 ist eine Variante des GO-ATeam2, die die mitochondriale Signalsequenz von Cytochrom c Oxidase Untereinheit VIIIA am Aminoterminus von GO-ATeam2 eingesetzt ist. ²⁷ Wir modifizierten die mitGO-ATeam2 Sonde (freundlicherweise vom Labor bereitgestellt H. Noji, Institut of Scientific and Industrial Research, Osaka University, Japan) zur Verwendung in Hefe durch Subklonierung es über Xba1 und HindIII in den Hefe-Expressionsvektor pAG415GPD-ccdB (Addgene, Cambridge, MA, USA), ein low-copy Plasmid mit dem starken konstitutiven GPD-Promotors. Wir drückten mitGO-ATeam2 in Bäckerhefe, und finden Sie durch Gegenfärbung mit dem DNA-bindenden Farbstoff DAPI, dass es lokalisiert ausschließlich auf Mitochondrien, wo es als ein effektives Sonde zu physiologischen Veränderungen in der mitochondrialen ATP-Spiegel zu messen.

roGFP und GO-ATeam sowohl genetisch codiert. Als Ergebnis können sie eingeführt und stabil beibehalten in intakten Zellen, und Informationen über Redox-Zustand oder ATP-Spiegel in einzelnen lebenden Zellen. Darüber hinaus überwachen beide Biosensoren Änderungen in Redox-Zustand oder ATP-Spiegel, die auftreten, unter physiologischen Bedingungen. ^28. Beide Sonden sind auch ratiometrischen. Als Ergebnis werden die Messungen mit diesen Fühlern aus nicht schwiernges in Biosensor Konzentration oder Probenbeleuchtung oder Dicke. Schließlich bieten beide Biosensoren subzelluläre räumliche Auflösung. Tatsächlich roGFP auf Mitochondrien, ER wurde gezielt Endosomen und Peroxisomen ²⁴ und kann Änderungen in Redox-Zustand von jedem dieser Organellen, weitgehend unabhängig vom pH erkennen.

Protocol

1. Transformation von Hefezellen mit den Biosensoren Verwandeln Sie den gewünschten Hefestamm mit Plasmid Lager mito-roGFP oder mitGO-ATeam2 mit dem Lithiumacetatverfahren 27. Zur Transformation mit dem Plasmid-borne Biosensor zu bestätigen und um den Verlust des Plasmids zu verhindern, auszuwählen und aufzubewahren Transformanten auf den entsprechenden selektiven synthetischen Vollmedium (SC-Ura für Mito-roGFP oder SC-Leu für mitGo-ATeam2). Wenn das fluoreszierende Sonde in einem an…

Representative Results

Messen mitochondrialen Redox-Zustand mit Mito-roGFP Hier zeigen wir, dass mito-roGFP1 den dynamischen Bereich hat, um Änderungen in der mitochondrialen Redox-Zustand von vollständig oxidiert zu erfassen, um in lebenden Hefezellen reduziert, ohne die Hefe das Zellwachstum oder die mitochondriale Morphologie. Zunächst finden wir Zellen, Mitochondrien gezielte GFP und roGFP1 wachsen zu normalen Tarifen (Abbildung 1A). Die maximale Wachstumsrate, wie maximale Steigung der Wachst…

Discussion

Hier beschreiben wir Methoden, um mito-roGFP1 und mitGO-ATeam2 als Biosensoren nutzen zu mitochondrialen Redox-Zustand und ATP-Spiegel in lebenden Hefezellen zu beurteilen. Wir finden, dass die Expression von Plasmid-borne mito-roGFP1 oder mitGO-ATeam Ergebnisse in quantitativer Ausrichtung auf Mitochondrien, ohne offensichtliche Wirkung auf die mitochondriale Morphologie oder die Verbreitung oder auf zellulären Wachstumsraten. ³ Mito-roGFP1 können Änderungen in der mitochondrialen Redox-Zustand von stark …

Materials

			Reagents
Antimycin A	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	1397-94-0	Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.
SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glycerol 0.05% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
Valap			Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin
			Equipment and Software
Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides	Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)	3050	Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm
High-performance coverslips, No. 1.5, 18×18 mm	Zeiss (Thornwood, NY)	474030-9000-000	These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance
Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)	12-545E	Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm)
A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective	Nikon (Melville, NY)
AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software	Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)
Volocity 3D Image Analysis software	Perkin Elmer (Waltham, MA)		Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement
ImageJ software	National Institutes of Health (Bethesda, MD)		http://rsb.info.nih.gov/ij/