Biosensors רציומטרי שלמדוד את מצב חיזור מיטוכונדריאלי וה-ATP בתאי שמרי חיים

Summary

אנו מתארים את השימוש בשני חיישנים ביולוגיים, מקודדים גנטי ratiometric, המבוססים על ה-GFP, כדי לפקח על מצב חיזור המיטוכונדריה ורמות ה-ATP ברזולוציה subcellular בתאי שמרי חיים.

Abstract

יש לי המיטוכונדריה תפקידים בתהליכים תאיים רבים, מחילוף חומרים של אנרגיה והומאוסטזיס סידן לשלוט של הסלולר תוחלת חיים ומות תאים מתוכנת. תהליכים אלה משפיעים ומושפעים מהמצב של חיזור וייצור ATP במיטוכונדריה. כאן, אנו מתארים את השימוש בשני חיישנים ביולוגיים ratiometric, מקודדים גנטי שיכול לזהות מצב חיזור המיטוכונדריה ורמות ה-ATP ברזולוציה subcellular בתאים חי שמרים. מדינת חמזור מיטוכונדריאלי נמדדת באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק חיזור רגיש (roGFP) כי הוא ממוקד למטריקס המיטוכונדריה. מיטו-roGFP מכיל cysteines בעמדות 147 ו -204 של ה-GFP, אשר עוברות חמצון הפיך ותלוי בסביבה וצמצום, אשר בתורו משנה את ספקטרום העירור של החלבון. MitGO-ATeam היא העברת פורסטר תהודה אנרגיה (סריג) בדיקה שבמקטע של ε _o F F-ATP synthase ₁ הוא דחוקה בין סריג תורם acceptor fluoחלבוני rescent. כריכה של ה-ATP לתוצאות מקטע ε בשינויי קונפורמציה בחלבון המביאים סריג תורם acceptor בסמיכות ומאפשרת העברת אנרגיה תהודה הקרינה מהתורם לacceptor.

Introduction

המיטוכונדריה הם אברונים חיוניים לייצור ה-ATP, סינתזה של חומצות אמינו, חומצות שומן, heme, ברזל וגופרית אשכולות pyrimidines. מיטוכונדריה גם לשחק תפקידים מרכזיים בומאוסטזיס סידן, וברגולציה של אפופטוזיס. ¹ קישורי ראיות הגדלת מיטוכונדריה למחלות הזדקנות וקשורות לגיל, כולל מחלת פרקינסון, אלצהיימר, טרשת לרוחב amyotrophic, ומחלת הנטינגטון. ² בעוד אנשים חיים את כל חייהם עם מוטציות בחלבוני המיטוכונדריה הקשורים למחלות ניווניות, את תסמיני המחלה מתרחשות רק מאוחר יותר בחיים. זה מצביע על כך ששינויים מתרחשים במיטוכונדריה עם גיל שיאפשר מחלת הפתולוגיה לצוץ. ואכן, כושר המיטוכונדריה הוא מתואם עם בריאות כללית תא ותוחלת חיים בשמרים ותאי יונקים. ^3,4 כאן, אנו מתארים כיצד להשתמש בחיישנים ביולוגיים גנטי מקודדים, רציומטרי ניאון כדי להעריך שני מאפיינים קריטיים של mitochondria בתאים חי שמרים: מדינת חיזור ורמות ה-ATP.

תפקוד המיטוכונדריה בגיוס אנרגיה אירובי הוא מבוסס היטב. מדינת חמזור מיטוכונדריאלי היא תוצר של הפחתת חמצון ומינים באברון, כולל NAD ⁺ / NADH, FAD / FADH _2, NADP ⁺ / NADPH, דיסולפיד גלוטתיון / גלוטתיון (GSH / GSSG) ומיני חמצן תגובתי (ROS). שחרר את סוגר המיטוכונדריה או היפוקסיה משפיע על פעילות נשימה המיטוכונדריה ומשנה את היחס בין NAD ⁺ ל NADH באברון. ROS, אשר מיוצרים מהעברת אלקטרון בין קומפלקסים לא יעילה של שרשרת העברת האלקטרונים בקרום המיטוכונדריה הפנימית, כמו גם מdeamination של אמינים באמצעות מונואמין אוקסידאז בקרום החיצוני של המיטוכונדריה ^5, שומנים, חלבונים, נזק וחומצות גרעין ויש לי נקשר להזדקנות ומחלות ניווניות גיל הקשורים ^6,7,8. ROS גם לשחק תפקיד בהעברת אותות במ 'itochondria, באמצעות חמצון של GSH. לדוגמה, NADH דהידרוגנז לא רק תורם לייצור ROS אלא גם מוסדר באמצעות אינטראקציות עם בריכת גלוטתיון ^9,10. דהידרוגנז וaconitase α-ketoglutarate, רכיבים של מחזור TCA, מפגינים פעילות מופחתת בחמצון סביבות ^11,12.

ואכן, תקנת חיזור תלויה של פעילות aconitase נשמרת מחיידקים ליונקים ^13,14. לפיכך, ניטור מצב חיזור ורמות ה-ATP של המיטוכונדריה הוא חיוני להבנת תפקודם והתפקיד במחלת פתולוגיה.

שיטות ביוכימיות שמשו כדי להעריך את מצב חיזור או רמות ה-ATP בתאים שלמים או מבודד מיטוכונדריה. שיטות המשמשות באופן נרחב כדי להעריך את מצב חיזור של תאים או שלמים מבודדת המיטוכונדריה מבוססות על מדידת הרמות של זוג חמזור GSH / GSSG ^15. המערכת נמצאת בשימוש luciferin-לוציפראז נפוץ למדידת המיטוכונדריהרמות ה-ATP בכל תאים שלמים permeabilized או מבודד המיטוכונדריה. ^{16,17,18,19,20} ב assay זה, לוציפראז נקשר ה-ATP ומזרזת חמצון של וchemiluminescence מluciferin. ²¹ עוצמת האור הנפלט הוא ביחס ישר לכמות של ה-ATP בתערובת התגובה. ²²

שיטות אלה חשפו מידע מהותי בנוגע לתפקוד המיטוכונדריה, כולל מציאת כי בחולים עם מחלות ניווניות, כמו מחלת אלצהיימר, יש רמות נמוכות באופן חריג ה-ATP. ²³ עם זאת, הם לא יכולים לשמש למגורים, תמונת תאים שלמים. יתר על כן, שיטות המבוססות על ניתוח כל התא מספקות ממוצעת של מדינת חיזור או רמות ה-ATP בכל התאים של התא. מדידות באברונים מבודדים הן פוטנציאל בעייתיים משום שמדינת חמזור המיטוכונדריה או רמות ה-ATP עשויה להשתנות במהלך חלוקה subcellular. לבסוף, מחקרים שנעשה לאחרונה מהמעבדה ועוד מצביעים על כךהמיטוכונדריה בתוך תאים בודדים הן הטרוגנית בפונקציה, אשר בתורו משפיעה על תוחלת החיים של תאים אם ובתה. ³ לפיכך, יש צורך למדוד את רמות ה-ATP והמיטוכונדריה מדינת חיזור בתאים חיים עם הרזולוציה subcellular.

את biosensors לתפקוד המיטוכונדריה מתואר כאן הם על בסיס ה-GFP. GFP חיזור רגיש (roGFP) ^24,25 הוא גרסת ה-GFP שבו מוסף החשוף על פני השטח cysteines למולקולה. roGFP, כמו פראי סוג של GFP, יש שתי פסגות עירור (ב ~ 400 ננומטר ו ~ 480 ננומטר) ושיא פליטה אחד ב~ 510 ננומטר. חמצון של שאריות ציסטאין בתוצאות roGFP בעלייה בעירור ב ~ 400 ננומטר. הפחתה של cysteines האלה מעדיפה עירור ב ~ 480 ננומטר. לפיכך, היחס בין פליטת ננומטר 510 על עירור של roGFP ב480 ננומטר ו -400 ננומטר מגלה את הכמות היחסית של חמצון מופחת וroGFP, המשקף את מצב חיזור של הסביבה של fluorophore.

שני versיונים של roGFP נמצאים בשימוש נרחב: roGFP1 וroGFP2. שניהם מכילים את אותם הוספות ציסטאין. roGFP1 מבוסס על פראי סוג GFP וroGFP2 מבוסס על S65T GFP, שבו יש עירור יעיל יותר ב480 ננומטר ופחות יעיל בעירור 400 ננומטר לעומת wtGFP ^24. roGFP1 הוא פחות רגיש מאשר pH roGFP2 והטווח הדינמי שלה מרחיב עוד יותר לתוך הטווח המופחת. לפיכך, roGFP1 עשויה להיות שימושי יותר לניטור תאים יותר להפחתה כגון המיטוכונדריה או cytosol, ותאים בעלי חומציות משתנה, כגון endosomes. roGFP2 מציע אות בהירה, בחלק מהמחקרים, טווח דינמי גדול יותר מroGFP1 ^24,26. מחקרים בthaliana ארבידופסיס מצביעים על כך שהזמן הנדרש לתגובה לשינויים במצב חיזור הוא דומה בשני החיישנים (t ½ לחמצון, 65 ו -95 שניות ולא ½ להפחתה, 272 ו 206 שניות, לroGFP1 וroGFP2, בהתאמה). ²⁶

MitGO-ATeam2 הוא פולשנית, אמינהחיישן שמודד את המיטוכונדריה ה-ATP בcerevisiae Saccharomyces שמרי ניצנים. GO-ATeam הוא העברת פורסטר תהודה אנרגיה (סריג) בדיקה שמורכבת המקטע של ε F _o F-ATP synthase ₁ דחוקה בין סריג תורם וחלבוני ניאון acceptor (GFP וכתום חלבון פלואורסצנטי (OFP), בהתאמה). ²⁷ כריכה של ה-ATP לתוצאות מקטע ε בשינויי קונפורמציה בחלבון המביאים סריג תורם בסמיכות לacceptor ולאפשר להעברת אנרגיה מתורם לacceptor. ישנן שתי גרסאות של Go-ATeam, GO-ATeam1 וללכת-ATeam2. יש GO-ATeam2 זיקה גבוהה יותר לMgATP מאשר ללכת-ATeam1, מה שהופך אותו מתאים יותר למדידה בדרך כלל נמוכים יותר [ATP] במיטוכונדריה לעומת cytosol. ²⁷

לחקור מדינת חמזור המיטוכונדריה, אנו נבנו חלבון היתוך (מיטו-roGFP1) בהיקף של roGFP1 התמזג רצף מנהיג ATP9ND הביע מביטוי שמרי centromere מבוסס (מספר עותק נמוך) פלסמיד תחת שליטה של ​​דהידרוגנז glyceraldehyde-3-פוספט החזק (GPD) האמרגן (p416GPD, Addgene). אנחנו השתמשנו roGFP1 לחקור את מצב חיזור של המיטוכונדריה בהקשר של הזדקנות של cerevisiae Saccharomyces פטריית המודל. אנו מוצאים כי roGFP1 יכול לזהות שינויים במצב חיזור המיטוכונדריה המתרחשים במהלך הזדקנות ובתגובה לזמינות חומרי הזנה, אבל אין כל השפעה מזיקה לכאורה על תאי שמרים. כמו כן, אנו רואים השתנות במצב חיזור של המיטוכונדריה בתוך תאי שמרי חיים בודדים, ממצא זה מדגיש את החשיבות של biosensor עם רזולוציה מרחבית subcellular.

MitGO-ATeam2 הנו נגזרת של GO-ATeam2, שבו יש רצף של המיטוכונדריה אות VIIIA מקטע מונואמין ג ציטוכרום הוכנס בתחנה הסופית של אמין GO-ATeam2. ^-27 שונה חללית mitGO-ATeam2 (בחביבות על ידי המעבדה של ח Noji, מכון OF מדע ומחקר תעשייתי, אוניברסיטת אוסקה, יפן) לשימוש בשמרים על ידי subcloning, באמצעות Xba1 ואתרי HindIII, לתוך וקטור ביטוי שמרי pAG415GPD-ccdB (Addgene, קיימברידג', מסצ'וסטס, ארה"ב), שהוא נמוך עותק פלסמיד המכיל את אמרגן GPD המכונן החזק. אנחנו הביעו mitGO-ATeam2 בשמרי ניצנים, ולמצוא, לפי counterstaining עם הצבע DAPI-DNA המחייב, כי זה localizes באופן בלעדי למיטוכונדריה, שם היא משמשת כבדיקה יעילה למדידת שינויים פיסיולוגיים ברמות ה-ATP המיטוכונדריה.

roGFP וללכת-ATeam שניהם מקודדים גנטי. כתוצאה מכך, הם יכולים להיות הציגו ומתוחזק ביציבות בתאים שלמים, ולספק מידע על מצב חיזור או רמות ה-ATP בתאים בודדים, המתגוררים. יתר על כן, שני biosensors לעקוב אחר שינויים במצב חיזור או רמות ה-ATP שמתרחשות בתנאים פיסיולוגיים. ²⁸ שתי הבדיקות גם ratiometric. כתוצאה מכך, מדידות שנעשו עם בדיקות אלה אינן מושפעות על ידי צ'הnges בריכוז biosensor או תאורת מדגם או עובי. לבסוף, שני biosensors לספק רזולוציה מרחבית subcellular. ואכן, roGFP כבר ממוקד למיטוכונדריה, ER, endosomes וperoxisomes ^24, ויכול לזהות שינויים במצב חיזור של כל אחד מהאברונים האלה, בלתי תלויים ברמת החומציות.

Protocol

1. טרנספורמציה של תאי שמרים עם Biosensors להפוך את זן השמרים הרצויים עם פלסמיד נושא מיטו-roGFP או mitGO-ATeam2 בשיטה אצטט ליתיום 27. כדי לאשר את השינוי עם biosensor פלסמיד הנישא ועל מנת למנוע אובדן של פלסמ…

Representative Results

מדידת מדינת חמזור המיטוכונדריה עם מיטו-roGFP כאן, אנו מראים שיש לו מיטו-roGFP1 הטווח הדינמי כדי לזהות שינויים במצב חיזור המיטוכונדריה מחמצון מופחת באופן מלא לחיים בתאי שמרים, מבלי להשפיע על צמיחת תאי שמרים או במורפולוגיה של המיטוכונדרי…

Discussion

כאן, אנו מתארים שיטות לשימוש מיטו-roGFP1 וmitGO-ATeam2 כחיישנים ביולוגיים להערכת מצב חיזור המיטוכונדריה ורמות ה-ATP בתאים חי שמרים. אנו מוצאים את ביטוי שתוצאות פלסמיד שמקורן מיטו-roGFP1 או mitGO-ATeam בכמותית המיקוד למיטוכונדריה, ללא כל השפעה ברורה על מורפולוגיה של המיטוכונדריה או הפ?…

Materials

			Reagents
Antimycin A	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	1397-94-0	Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.
SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glycerol 0.05% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
Valap			Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin
			Equipment and Software
Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides	Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)	3050	Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm
High-performance coverslips, No. 1.5, 18×18 mm	Zeiss (Thornwood, NY)	474030-9000-000	These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance
Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)	12-545E	Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm)
A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective	Nikon (Melville, NY)
AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software	Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)
Volocity 3D Image Analysis software	Perkin Elmer (Waltham, MA)		Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement
ImageJ software	National Institutes of Health (Bethesda, MD)		http://rsb.info.nih.gov/ij/