लिविंग खमीर कोशिकाओं में Mitochondrial रिडॉक्स राज्य और एटीपी उपाय है कि ratiometric Biosensors
Summary
हम रह खमीर कोशिकाओं में subcellular संकल्प पर मितोचोन्द्रिअल redox राज्य और एटीपी के स्तर पर नजर रखने के लिए, GFP के आधार पर कर रहे हैं जो दो ratiometric, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग, biosensors के उपयोग का वर्णन.
Abstract
Mitochondria ऊर्जा चयापचय और सेलुलर उम्र और क्रमादेशित कोशिका मृत्यु का नियंत्रण करने के लिए कैल्शियम homeostasis से, कई सेलुलर प्रक्रियाओं में भूमिका है. इन प्रक्रियाओं को प्रभावित और के redox स्थिति और माइटोकांड्रिया द्वारा एटीपी उत्पादन से प्रभावित हैं. यहाँ, हम खमीर जीवित कोशिकाओं में subcellular संकल्प पर मितोचोन्द्रिअल redox राज्य और एटीपी के स्तर का पता लगा सकते हैं कि दो ratiometric, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग biosensors के उपयोग का वर्णन. Mitochondrial रेडोक्स राज्य मितोचोन्द्रिअल मैट्रिक्स करने का लक्ष्य है कि redox के प्रति संवेदनशील हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (roGFP) का उपयोग कर मापा जाता है. मिटो-roGFP बदले में प्रोटीन की उत्तेजना स्पेक्ट्रम बदल जो प्रतिवर्ती और पर्यावरण पर निर्भर ऑक्सीकरण और कमी, गुजरना जो पदों 147 और GFP की 204, पर cysteines होता है. MitGO-ATeam एफ ओ की ε सबयूनिट एफ 1-एटीपी synthase के बीच sandwiched है जिसमें एक Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) जांच है दाता और स्वीकर्ता fluo झल्लाहटrescent प्रोटीन. लाने कि प्रोटीन में रचना परिवर्तन में ε सबयूनिट परिणाम को एटीपी के बंधन करीब निकटता में दाता और स्वीकर्ता झल्लाहट और दाता से स्वीकर्ता प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण के लिए अनुमति देते हैं.
Introduction
माइटोकॉन्ड्रिया अमीनो एसिड, फैटी एसिड, हीम, लोहे सल्फर समूहों और pyrimidines की एटीपी उत्पादन, जैव संश्लेषण के लिए आवश्यक organelles के हैं. माइटोकॉन्ड्रिया भी कैल्शियम homeostasis में निर्णायक भूमिका निभाते हैं, और apoptosis के नियमन में. पार्किंसंस रोग, अल्जाइमर रोग, amyotrophic पार्श्व काठिन्य, और Huntington रोग सहित उम्र बढ़ने और उम्र से संबंधित बीमारियों के लिए माइटोकांड्रिया 1 बढ़ाने सबूत लिंक. 2 व्यक्तियों के साथ अपनी पूरी जिंदगी रहते हैं neurodegenerative रोगों के साथ जुड़े रहे हैं कि mitochondrial प्रोटीन में उत्परिवर्तन, रोग के लक्षण केवल बाद के जीवन में होते हैं. यह परिवर्तन है कि उभरने की विकृति रोग की अनुमति है कि उम्र के साथ माइटोकॉन्ड्रिया में होने का संकेत है. दरअसल, मितोचोन्द्रिअल फिटनेस समग्र सेल स्वास्थ्य और उम्र खमीर में और स्तनधारी कोशिकाओं के साथ जोड़ा जाता है. यहाँ 3,4, हम mitoc के दो महत्वपूर्ण सुविधाओं का आकलन करने के लिए आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग, ratiometric फ्लोरोसेंट biosensors के उपयोग करने के लिए कैसे का वर्णनखमीर कोशिकाओं में रहने वाले hondria: redox राज्य और एटीपी के स्तर.
एरोबिक ऊर्जा जुटाने में mitochondrial समारोह अच्छी तरह से स्थापित है. Mitochondrial रेडोक्स राज्य NAD + / NADH, धुनी / FADH 2, NADP + / NADPH, ग्लूटाथैऑन / ग्लूटाथैऑन डाइसल्फ़ाइड (GSH / GSSG) और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) सहित, organelle में प्रजातियों को कम करने और ऑक्सीकरण का एक उत्पाद है. माइटोकांड्रिया या हाइपोक्सिया uncoupling mitochondrial श्वसन गतिविधि को प्रभावित करता है और NAD के अनुपात + organelle में NADH को परिवर्तित कर देता है. भीतरी mitochondrial झिल्ली में इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के परिसरों, साथ ही amines के deamination से बाहरी mitochondrial झिल्ली में monoamine oxidase के माध्यम से 5, नुकसान लिपिड, प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड के बीच अक्षम इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण से उत्पादित कर रहे हैं और जो आरओएस, 6,7,8 उम्र बढ़ने और उम्र जुड़े neurodegenerative रोगों से जोड़ा गया. आरओएस भी मीटर में संकेत पारगमन में एक भूमिका निभाitochondria, GSH के ऑक्सीकरण के माध्यम से. उदाहरण के लिए, NADH डिहाइड्रोजनेज आरओएस उत्पादन के लिए योगदान नहीं बल्कि ग्लूटाथैऑन पूल 9,10 के साथ बातचीत के माध्यम से नियंत्रित किया जाता है. α-ketoglutarate डिहाइड्रोजनेज और aconitase, TCA चक्र के घटकों, वातावरण 11,12 ऑक्सीकरण में कम गतिविधि दिखा रहे हैं.
दरअसल, aconitase गतिविधि के redox पर निर्भर विनियमन बैक्टीरिया से स्तनधारियों 13,14 के लिए संरक्षित है. इस प्रकार, redox राज्य और mitochondria की एटीपी स्तर की निगरानी रोग विकृति विज्ञान में उनके कार्य और भूमिका को समझने के लिए महत्वपूर्ण है.
बायोकेमिकल तरीकों रेडोक्स राज्य या पूरे कोशिकाओं के एटीपी के स्तर का आकलन किया या माइटोकांड्रिया पृथक किया गया है. पूरे कोशिकाओं या के redox स्थिति का आकलन करने के लिए व्यापक रूप से इस्तेमाल के तरीकों माइटोकांड्रिया पृथक रेडोक्स जोड़ी GSH / GSSG 15 के स्तर को मापने पर आधारित हैं. luciferin-luciferase प्रणाली सामान्यतः मितोचोन्द्रिअल को मापने के लिए प्रयोग किया जाता हैमाइटोकॉन्ड्रिया permeabilized पूरे कोशिकाओं या अलग से किसी में एटीपी के स्तर. 16,17,18,19,20 इस परख में, luciferase राशि के लिए आनुपातिक है एटीपी को बांधता है और के ऑक्सीकरण और luciferin से chemiluminescence catalyzes. 21 उत्सर्जित प्रकाश की तीव्रता प्रतिक्रिया मिश्रण में एटीपी. 22 की
इन तरीकों में अल्जाइमर रोग जैसे neurodegenerative रोगों के साथ रोगियों असामान्य रूप से कम एटीपी स्तर है कि खोजने सहित mitochondrial समारोह, के बारे में बुनियादी जानकारी से पता चला है. 23 हालांकि, वे छवि रहते हैं, कोशिकाओं बरकरार करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता. इसके अलावा, पूरे सेल विश्लेषण पर आधारित विधियों रेडोक्स राज्य या सेल के सभी डिब्बों में एटीपी के स्तर के एक औसत प्रदान करते हैं. मितोचोन्द्रिअल रेडोक्स राज्य या एटीपी के स्तर subcellular fractionation के दौरान बदल सकते हैं क्योंकि अलग organelles में माप संभावित समस्याग्रस्त हैं. अंत में, हमारी प्रयोगशाला और दूसरों से हाल के अध्ययनों से संकेत मिलता है किव्यक्ति की कोशिकाओं के भीतर माइटोकांड्रिया बदले में मां और बेटी की कोशिकाओं के जीवन को प्रभावित करता है, जो समारोह में विषम हैं. 3 प्रकार, subcellular संकल्प के साथ जीवित कोशिकाओं में mitochondrial एटीपी स्तर और रेडोक्स राज्य उपाय करने की जरूरत है.
दोनों GFP के आधार पर कर रहे हैं mitochondrial समारोह के लिए biosensors यहाँ वर्णित है. Redox के प्रति संवेदनशील GFP (roGFP) 24,25 सतह उजागर cysteines अणु को जोड़ रहे हैं, जिसमें एक GFP संस्करण है. roGFP, जंगली प्रकार GFP की तरह, दो उत्तेजना चोटियों (~ 400 एनएम और ~ 480 एनएम) और ~ 510 एनएम पर एक उत्सर्जन चोटी है. ~ 400 एनएम पर उत्तेजना में वृद्धि में roGFP परिणामों में सिस्टीन अवशेषों के ऑक्सीकरण. उन cysteines की कमी ~ 480 एनएम उत्तेजना पक्ष में है. इस प्रकार, 480 एनएम और 400 एनएम पर roGFP की उत्तेजना पर 510 एनएम उत्सर्जन का अनुपात फ्लोरोफोरे के वातावरण के redox स्थिति को दर्शाता है जो कम और ऑक्सीकरण roGFP, के रिश्तेदार राशि का पता चलता है.
दो versroGFP के आयनों व्यापक रूप से इस्तेमाल कर रहे हैं: roGFP1 और roGFP2. दोनों ही सिस्टीन सम्मिलन होते हैं. roGFP1 जंगली प्रकार GFP पर आधारित है और roGFP2 wtGFP 24 की तुलना में 400 एनएम पर 480 एनएम और कम कुशल उत्तेजना में अधिक कुशल उत्तेजना है जो S65T GFP, पर आधारित है. roGFP1 roGFP2 और इसके गतिशील रेंज कम रेंज में आगे फैली से संवेदनशील कम पीएच है. इस प्रकार, roGFP1 अधिक कम करने में इस तरह के माइटोकॉन्ड्रिया के डिब्बों या साइटोसॉल, और इस तरह के endosomes के रूप में चर पीएच, के साथ डिब्बों की निगरानी के लिए और अधिक उपयोगी हो सकता है. roGFP2 उज्जवल संकेत और, कुछ अध्ययनों में, roGFP1 24,26 से अधिक गतिशील रेंज प्रदान करता है. Arabidopsis thaliana में अध्ययन redox राज्य में परिवर्तन करने के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए आवश्यक समय दोनों सेंसर (टी साढ़े ऑक्सीकरण के लिए, 65 और 95 सेकंड और टी साढ़े क्रमशः roGFP1 और roGFP2 के लिए कमी, 272 और 206 सेकंड,, के लिए) के लिए इसी तरह की है कि संकेत मिलता है. 26
MitGO-ATeam2 एक न्यूनतम इनवेसिव, विश्वसनीय हैनवोदित खमीर में mitochondrial एटीपी उपायों कि सेंसर. जाओ ATeam दाता और स्वीकर्ता फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP और नारंगी (OFP) प्रोटीन फ्लोरोसेंट, क्रमशः) झल्लाहट एफ ओ के बीच sandwiched एफ 1-एटीपी synthase ε सबयूनिट के होते हैं कि एक Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) जांच है. 27 लाने कि प्रोटीन में गठनात्मक परिवर्तन में ε सबयूनिट परिणाम को एटीपी के बंधन स्वीकर्ता के पास दाता झल्लाहट और दाता से स्वीकर्ता करने के लिए ऊर्जा के स्थानांतरण के लिए अनुमति देते हैं. जाओ ATeam, जाओ ATeam1 और जाओ ATeam2 के दो वेरिएंट हैं. जाओ ATeam2 आम तौर पर कम माइटोकांड्रिया में cytosol की तुलना [एटीपी]. 27 को मापने के लिए यह अधिक उपयुक्त बनाने, जाओ ATeam1 से MgATP के लिए एक उच्च संबंध है
मितोचोन्द्रिअल रेडोक्स राज्य की जांच के लिए हमने एक ATP9 नेता अनुक्रम के लिए जुड़े हुए roGFP1 से मिलकर एक संलयन प्रोटीन (मिटो-roGFP1) का निर्माणएन डी मजबूत glyceraldehyde-3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (GPD) प्रमोटर (p416GPD, Addgene) के नियंत्रण में प्लाज्मिड एक गुणसूत्रबिंदु आधारित (कम प्रतिलिपि संख्या) खमीर अभिव्यक्ति से व्यक्त की. हम मॉडल कवक Saccharomyces cerevisiae की उम्र बढ़ने के संदर्भ में माइटोकॉन्ड्रिया के redox स्थिति की जांच के लिए roGFP1 इस्तेमाल किया. हम roGFP1 उम्र बढ़ने के दौरान और पोषक तत्वों की उपलब्धता के जवाब में होते हैं लेकिन खमीर की कोशिकाओं पर कोई स्पष्ट हानिकारक प्रभाव पड़ता है कि mitochondrial redox राज्य में परिवर्तन का पता लगा सकते हैं कि लगता है. हम भी व्यक्ति जीवित खमीर कोशिकाओं के भीतर माइटोकांड्रिया के redox राज्य में परिवर्तनशीलता, subcellular स्थानिक संकल्प के साथ एक biosensor के महत्व को रेखांकित करता है कि एक खोज देखें.
MitGO-ATeam2 जाओ ATeam2 के अमीनो टर्मिनस पर डाला साइटोक्रोम ग oxidase सबयूनिट VIIIA की मितोचोन्द्रिअल संकेत अनुक्रम है जो जाओ ATeam2, का एक संस्करण है. 27 हम mitGO-ATeam2 जांच (कृपया एच. की प्रयोगशाला द्वारा प्रदान की संशोधित Noji, संस्थान ओच वैज्ञानिक और एक कम नकल प्लाज्मिड है जो खमीर अभिव्यक्ति वेक्टर pAG415GPD-ccdB (Addgene, कैम्ब्रिज, एमए, यूएसए), में Xba1 और HindIII साइटों के माध्यम से यह subcloning द्वारा खमीर में उपयोग के लिए औद्योगिक अनुसंधान, ओसाका विश्वविद्यालय, जापान),, मजबूत विधान GPD प्रमोटर युक्त. हम नवोदित खमीर में mitGO-ATeam2 व्यक्त की, और यह मितोचोन्द्रिअल एटीपी के स्तर में शारीरिक परिवर्तन को मापने के लिए एक प्रभावी जांच के रूप में कार्य करता है जहां यह माइटोकांड्रिया के लिए विशेष रूप से localizes कि डीएनए बाध्यकारी डाई DAPI, साथ counterstaining द्वारा, पाते हैं.
roGFP और जाओ ATeam आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग रहे हैं दोनों. नतीजतन, वे शुरू की है और स्थिरतापूर्वक बनाए रखा बरकरार कोशिकाओं में, और redox राज्य या व्यक्ति, जीवित कोशिकाओं में एटीपी के स्तर के बारे में जानकारी प्रदान की जा सकती है. इसके अलावा, दोनों biosensors के शारीरिक शर्तों के तहत रेडोक्स राज्य या होती है कि एटीपी के स्तर में परिवर्तन की निगरानी. 28 दोनों जांच भी ratiometric हैं. नतीजतन, इन जांच के साथ किए गए माप चा से प्रभावित नहीं हैंbiosensor एकाग्रता या नमूना रोशनी या मोटाई में nges. अंत में, दोनों biosensors के subcellular स्थानिक संकल्प प्रदान करते हैं. दरअसल, roGFP माइटोकांड्रिया, ईआर के लिए लक्षित किया गया है, endosomes और 24 पेरोक्सिज़ोम, और पीएच की काफी हद तक स्वतंत्र इन organelles के प्रत्येक के redox राज्य में परिवर्तन का पता लगा सकते हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम खमीर जीवित कोशिकाओं में mitochondrial redox राज्य और एटीपी के स्तर का आकलन करने के लिए biosensors के रूप में मिटो-roGFP1 और mitGO-ATeam2 उपयोग करने के तरीकों का वर्णन है. हम मात्रात्मक मितोचोन्द्रिअल आकारिकी या वितरण पर या से?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम HHMI 56006760 से (GM45735, JDV, DMAW को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) (2 TL1 आरआर 24158-6), के लिए और एलिसन मेडिकल फाउंडेशन (एजी-एसएस 2465) और एनआईएच से पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया GM45735S1 और GM096445) एल.पी. के लिए. GM45735S1 अमेरिकी रिकवरी और पुनर्निवेश अधिनियम 2009 के तहत एनआईएच से जारी किया गया था. इन अध्ययनों के लिए इस्तेमाल सूक्ष्मदर्शी एक NIH / NCI अनुदान (5 P30 CA13696) के माध्यम से हिस्से में समर्थित थे.
Materials
| Reagents | |||
| Antimycin A | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 1397-94-0 | Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution. |
| SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu |
Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glycerol 0.05% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine |
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| SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu |
Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine |
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| Valap | Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin |
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| Equipment and Software | |||
| Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides | Thomas Scientific (Swedesboro, NJ) | 3050 | Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm |
| High-performance coverslips, No. 1.5, 18×18 mm | Zeiss (Thornwood, NY) | 474030-9000-000 | These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance |
| Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5 | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) | 12-545E | Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm) |
| A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective | Nikon (Melville, NY) | ||
| AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software | Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan) | ||
| Volocity 3D Image Analysis software | Perkin Elmer (Waltham, MA) | Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement | |
| ImageJ software | National Institutes of Health (Bethesda, MD) | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
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