Biossensores raciométrica que medem estado redox mitocondrial e ATP em células vivas de levedura

Summary

Descreve-se a utilização de dois raciométrica, biossensores codificados geneticamente, que são baseados em GFP, para monitorar estado redox mitocondrial e os níveis de ATP na resolução subcelular em células vivas.

Abstract

As mitocôndrias têm um papel em muitos processos celulares, a partir do metabolismo da energia e homeostase do cálcio para controlar o tempo de vida de celular e morte celular programada. Esses processos afetam e são afetados pelo estado redox e de produção de ATP pela mitocôndria. Aqui, descrevemos o uso de dois, biossensores geneticamente codificados raciométrica que podem detectar estado redox mitocondrial e os níveis de ATP em resolução subcelular em células de levedura viva. Estado redox mitocondrial é medida usando Proteína Fluorescente Verde redox-sensível (roGFP) que é direcionado para a matriz mitocondrial. Mito-roGFP contém cisteínas nas posições 147 e 204 da GFP, que sofrem oxidação e redução reversível e dependente do ambiente, que por sua vez altera o espectro de excitação da proteína. MitGO-ATeam é uma transferência de energia de ressonância Förster (FRET) sonda em que a subunidade ε da F _o F ₁ ATP sintase é imprensada entre FRET doador e receptor fluoproteínas rescent. A ligação de ATP para as subunidades ε resulta em mudanças de conformação na proteína que trazem o dador e aceitador de FRET em estreita proximidade e permitir a transferência de energia de ressonância de fluorescência do dador ao receptor.

Introduction

As mitocôndrias são organelos essenciais para a produção de ATP, a biossíntese de aminoácidos, ácidos gordos, heme, aglomerados de enxofre do ferro e pirimidinas. As mitocôndrias também desempenham um papel fundamental na homeostase do cálcio e na regulação da apoptose. ^Uma crescente evidência de ligações mitocôndrias ao envelhecimento e doenças relacionadas à idade, incluindo a doença de Parkinson, doença de Alzheimer, esclerose lateral amiotrófica e doença de Huntington. ² Enquanto as pessoas vivem suas vidas inteiras com mutações em proteínas mitocondriais que estão associadas a doenças neurodegenerativas, os sintomas da doença ocorrerem apenas mais tarde na vida. Isto indica que as mudanças ocorrem nas mitocôndrias com a idade, que permitem a patologia a emergir. De fato, aptidão mitocondrial está relacionada com a saúde geral e longevidade celular em leveduras e células de mamíferos ^3,4 Aqui., Descrevemos como usar geneticamente codificados, biossensores fluorescentes raciométrica para avaliar dois aspectos críticos do mitochondria em células de levedura viva: o estado redox e os níveis de ATP.

Função mitocondrial na mobilização de energia aeróbica está bem estabelecida. Estado redox mitocondrial é um produto da redução e espécies oxidantes na organela, inclusive NAD ⁺ / NADH, FAD / FADH _2, NADP ⁺ / NADPH, glutationa / glutationa oxidada (GSH / GSSG) e espécies reativas de oxigênio (ROS). Desacoplamento mitocondrial ou hipóxia afeta a atividade respiratória mitocondrial e altera a relação de NAD ⁺ para NADH na organela. ROS, que são produzidos a partir de transferência de electrões entre ineficiente complexos da cadeia de transporte de electrões na membrana mitocondrial interna, bem como a partir da desaminação de aminas através da monoamina oxidase na membrana mitocondrial externa ^5, lípidos, proteínas, danos e ácidos nucleicos e têm foi associada ao envelhecimento e as doenças neurodegenerativas associadas à idade ^6,7,8. ROS também desempenhar um papel na transdução de sinal em mitochondria, através da oxidação de GSH. Por exemplo, NADH desidrogenase não só contribui para a produção de ROS, mas também é regulada através de interações com o pool de glutationa ^9,10. desidrogenase α-cetoglutarato e aconitase, componentes do ciclo do TCA, exibem uma actividade reduzida em ambientes oxidantes ^11,12.

Na verdade, a regulação redox dependente da atividade aconitase é conservada de bactérias a mamíferos ^13,14. Assim, o monitoramento do estado redox e os níveis de ATP das mitocôndrias é crucial para entender sua função e papel na patologia da doença.

Métodos bioquímicos têm sido usados ​​para avaliar o estado redox, ou os níveis de ATP de células inteiras ou mitocôndrias isoladas. Métodos amplamente utilizadas para avaliar o estado redox de células inteiras ou mitocôndrias isoladas são baseadas na medição dos níveis do par redox de GSH / GSSG ^15. O sistema luciferina-luciferase é comumente usado para medir mitocondrialEm ambos os níveis de ATP de células inteiras permeabilizadas ou mitocôndrias isoladas. ^{16,17,18,19,20} Neste ensaio, liga-se a luciferase de ATP e catalisa a oxidação da luciferina e de quimioluminescência. ²¹ A intensidade da luz emitida é proporcional à quantidade de ATP na mistura reaccional ^22.

Estes métodos têm revelado informação fundamental em relação a função mitocondrial, incluindo a descoberta de que os pacientes com doenças neurodegenerativas, tais como doença de Alzheimer, têm níveis anormalmente baixos de ATP ^23. No entanto, eles não podem ser utilizados para a imagem de vida, as células intactas. Além disso, os métodos baseados na análise de célula completa fornecer uma média de estado redox, ou os níveis de ATP em todos os compartimentos da célula. Medidas em organelas isoladas são potencialmente problemático porque o estado redox mitocondrial ou níveis de ATP podem mudar durante o fracionamento subcelular. Finalmente, estudos recentes do nosso laboratório e outros indicam quemitocôndrias dentro das células individuais são heterogêneos em função, que por sua vez afeta a vida útil das células-mãe e filha. ³ Assim, há uma necessidade de medir os níveis de ATP mitocondrial e estado redox em células vivas com resolução subcelular.

Os biossensores para a função mitocondrial descrita aqui são ambos baseados em boas práticas agrícolas. GFP Redox-sensível (roGFP) ^24,25 é uma variante da GFP em que superfície expostas cisteínas são adicionados à molécula. roGFP, como a GFP do tipo selvagem, que apresenta dois picos de excitação (em ~ 400 nm e ~ 480 nm) e um pico de emissão a 510 nm ~. A oxidação dos resíduos de cisteína em roGFP resulta em um aumento na absorção a 400 nm, ~. Redução dos cisteínas favorece excitação a 480 nm, ~. Assim, a razão de emissão de 510 nm após excitação de roGFP em 480 nm e 400 nm, revela a quantidade relativa de roGFP reduzida e oxidada, o que reflecte o estado redox do meio ambiente do fluoróforo.

Duas versiões de roGFP são amplamente utilizados: roGFP1 e roGFP2. Ambos contêm as mesmas inserções de cisteína. roGFP1 baseia-se na GFP do tipo selvagem e roGFP2 baseia-S65T GFP, que tem mais eficiente excitação a 480 nm e menos eficiente de excitação a 400 nm em comparação com wtGFP ^24. roGFP1 é menos sensível do que o pH roGFP2 e a sua gama dinâmica estende ainda mais para o intervalo reduzido. Assim, roGFP1 pode ser mais útil para o monitoramento mais reduzindo compartimentos tais como mitocôndrias ou citosol, e compartimentos com pH variável, como endossomos. roGFP2 oferece sinal brilhante e, em alguns estudos, uma maior gama dinâmica do que roGFP1 ^24,26. Estudos em Arabidopsis thaliana indicam que o tempo necessário para responder a alterações no estado redox é similar para ambos os sensores (t ½ para oxidação, 65 e 95 s e t ½ para redução, 272 e 206 segundos, o que roGFP1 e roGFP2, respectivamente) ^26.

MitGO-ATeam2 é minimamente invasivo, confiávelsensor que mede ATP mitocondrial no brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae. GO-ATeam é uma transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) de sonda, que consiste na subunidade da ε _o F F _1-ATP sintase ensanduichada entre dador FRET e proteínas aceitadoras fluorescentes GFP (proteína fluorescente e laranja (OFP), respectivamente), ^27. A ligação de ATP para as subunidades ε resulta em mudanças de conformação na proteína que trazem o dador FRET em estreita proximidade com o receptor e para permitir a transferência de energia entre o dador eo aceitador. Existem duas variantes da GO-ATeam, GO-ATeam1 e GO-ATeam2. GO-ATeam2 tem uma maior afinidade para MgATP que GO-ATeam1, tornando-o mais adequado para medir o tipicamente inferior [ATP], em comparação com as mitocôndrias do citosol ^27.

Para sondar estado redox mitocondrial, construiu-se uma proteína de fusão (mito-roGFP1) consistindo de roGFP1 fundido com a sequência líder de um ATP9nd expresso a partir de um centrómero baseado (baixo número de cópias) o plasmídeo de expressão de levedura sob o controlo do forte desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato (GPD) promotor (p416GPD, Addgene). Usamos roGFP1 para sondar o estado redox de mitocôndrias no contexto do envelhecimento do modelo fungo Saccharomyces cerevisiae. Descobrimos que roGFP1 pode detectar alterações no estado redox mitocondrial que ocorrem durante o envelhecimento e em resposta a disponibilidade de nutrientes, mas não tem nenhum efeito prejudicial aparente em células de levedura. Vemos também a variabilidade no estado redox de mitocôndrias nas células de leveduras vivas individuais, o que reafirma a importância de um biosensor com resolução espacial subcelular.

MitGO-ATeam2 é uma variante da GO-ATeam2, que tem a sequência de sinal mitocondrial do citocromo c oxidase subunidade VIII inserido no terminal amino da GO-ATeam2 ^27. Nós modificamos o mitGO-ATeam2 sonda (gentilmente cedido pelo laboratório de H. Noji, o Institutof Scientific e Industrial Research, Universidade de Osaka, Japão), para utilização em levedura por subclonagem-lo, através de Xba1 e locais HindIII, no vector de expressão de levedura pAG415GPD-ccdB (Addgene, Cambridge, MA, EUA), que é um plasmídeo de cópia de baixa contendo o promotor GPD constitutivo forte. Expressamos mitGO-ATeam2 em levedura de brotamento, e encontrar, pela coloração de contraste com o DNA-binding corante DAPI, que localiza exclusivamente para a mitocôndria, onde ele serve como uma sonda eficaz para medir as mudanças fisiológicas em níveis de ATP mitocondrial.

roGFP e GO-ATeam ambos são geneticamente codificado. Como resultado, eles podem ser introduzidos e mantidos de forma estável em células intactas, e fornecem informações sobre o estado redox, ou os níveis de ATP, em células vivas individuais. Além disso, ambos os biossensores monitorar as alterações no estado redox ou níveis de ATP que ocorrem sob condições fisiológicas. ²⁸ Ambas as sondas são também raciométrica. Como resultado, as medições feitas com estes testes não são afetados por changes na concentração biosensor ou iluminação da amostra ou espessura. Finalmente, ambos os biossensores fornecer resolução espacial subcelular. Com efeito, roGFP foi orientada de mitocôndrias, ER, endossomas e peroxissomas ^24, e pode detectar alterações no estado redox de cada um destes organelos, em grande parte independentes do pH.

Protocol

1. Transformação de células de levedura com o Biossensores Transformar a estirpe de levedura com o plasmídeo desejado Mito-roGFP ou mitGO-ATeam2 usando o método do acetato de lítio 27. Para confirmar a transformação com o plasmídeo de biossensor de origem e para evitar a perda do plasmídeo, seleccionar e manter os transformantes no meio completo sintético selectivo apropriado (SC-Ura para Mito-roGFP, ou SC-Leu por mitGo-ATeam2). Se a sonda fluorescente foi subclonado num plasm?…

Representative Results

Medindo estado redox mitocondrial com mito-roGFP Aqui, mostramos que mito-roGFP1 tem a gama dinâmica para detectar alterações no estado redox mitocondrial de totalmente oxidado a reduzida em células de levedura viva, sem afetar o crescimento de células de levedura ou morfologia mitocondrial. Primeiro, encontramos células que expressam GFP mitocôndrias-alvo e roGFP1 crescer a taxas normais (Figura 1A). A taxa de crescimento máxima, tal como medido pelo declive máximo da…

Discussion

Aqui, descrevemos métodos para usar mito-roGFP1 e mitGO-ATeam2 como biossensores para avaliar o estado redox mitocondrial e os níveis de ATP em células de levedura viva. Nós achamos que a expressão de plasmídeo de origem mito-roGFP1 ou mitGO-ATeam resulta em quantitativo direcionamento para mitocôndria, sem qualquer efeito óbvio sobre a morfologia e distribuição mitocondrial ou nas taxas de crescimento celular. ³ Mito-roGFP1 pode detectar alterações no estado redox mitocondrial de altamente oxidad…

Materials

			Reagents
Antimycin A	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	1397-94-0	Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.
SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glycerol 0.05% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
Valap			Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin
			Equipment and Software
Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides	Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)	3050	Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm
High-performance coverslips, No. 1.5, 18×18 mm	Zeiss (Thornwood, NY)	474030-9000-000	These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance
Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)	12-545E	Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm)
A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective	Nikon (Melville, NY)
AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software	Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)
Volocity 3D Image Analysis software	Perkin Elmer (Waltham, MA)		Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement
ImageJ software	National Institutes of Health (Bethesda, MD)		http://rsb.info.nih.gov/ij/