Temporele Kwantificering van MAPK geïnduceerde expressie in Single gistcellen
Summary
Twee aanvullende methoden op basis van flowcytometrie en microscopie gepresenteerd die de kwantificering van de enkele cel, de dynamiek van genexpressie geïnduceerd door de activering van MAPK route in gist mogelijk.
Abstract
De kwantificering van genexpressie op het eencellige niveau onthult nieuwe regulerende mechanismen verduisterd in de metingen uitgevoerd op populatieniveau. Twee methoden op basis van microscopie en flowcytometrie worden aangetoond hoe dergelijke gegevens kunnen worden verkregen. De expressie van een fluorescerende reporter geïnduceerd na activering van de hoge osmolariteit glycerol MAPK route in gist wordt gebruikt als een voorbeeld. De specifieke voordelen van elke methode worden gemarkeerd. Flowcytometrie meet een groot aantal cellen (10.000) en een directe maat voor de dynamiek van eiwitexpressie onafhankelijk van de langzame rijping kinetiek van het fluorescerende eiwit. Beeldvorming van levende cellen door microscopie is daarentegen beperkt tot het meten van de gerijpte vorm van de reporter in minder cellen. Echter, de datasets gegenereerd door deze techniek zeer rijk dankzij de combinatie van meerdere reporters en de ruimtelijke en temporele informatieverkregen van individuele cellen. De combinatie van deze twee meetmethoden kunnen nieuwe inzichten in de regulatie van eiwitexpressie leveren door signaalwegen.
Introduction
Signalering via transductie cascades vaak culmineert in de expressie van eiwitten. De karakterisering van deze expressieprofiel is een belangrijk element in het begrijpen van de functie van biologische wegen. De identificatie van het spectrum van up-gereguleerde eiwitten en de dynamiek van hun activering kan worden bereikt door verschillende technieken, zoals micro-arrays, Northern blots en Western-blots 1-3. Echter, deze technieken gemiddelde van de respons van een gehele celpopulatie. De fijne regeling van de expressie van eiwitten te begrijpen, is het wenselijk om metingen te verzamelen op enkele cel. Idealiter zouden deze metingen ook kwantitatieve gegevens vatbaar voor wiskundige modellen van de onderliggende route ontwikkelen.
Microscopie en flowcytometrie zijn twee technieken die ideaal zijn voor dergelijke kwantitatieve cel metingen leveren. De endogene labelen van proteïnen met een fluorescerend eiwit kan be gebruikt om hun expressie niveau 4 te kwantificeren. Aangezien de toevoeging van een grote fluorescente groep aan het uiteinde van het eiwit niet meer werkt kan weergeven, is het vaak wenselijk om specifieke expressie reporters basis van een promotor die de expressie van een fluorescente construct te genereren. Deze verslaggever eiwit is exogeen aan het cellulaire systeem en dus niet de signalering evenementen die plaatsvinden in de cel beïnvloeden.
Zowel microscopie en flowcytometrie zijn op grote schaal gebruikt in de signaleringsveld gist. Als voorbeelden, Colman-Lerner en collega gecorreleerd, in enkele cellen, de expressie van specifieke paring en constitutief tot expressie reporters door microscopie om de ruis in gist paring signaaltransductiecascade 5 kwantificeren Acar en collega's flowcytometrie om de regelgevingsnetwerk bestuderen die de expressie van GAL genen 6. In een eerdere studie 7, hebben we een combinati gebruiktop van deze twee technieken om de uitdrukking uitgang bestuderen van de hoge osmolariteit glycerol (HOG) route in gist. Dit mitogeen geactiveerd proteïne kinase (MAPK) route wordt geactiveerd door hyper-osmotische stress. Het resulteert in de activatie van de MAPK Hog1, die naar de kern van de cel om transcriptie programma resulteert in de expressie van ongeveer 300 genen induceren. Om dit te bestuderen, hebben we een uitdrukking reporter gebaseerd op STL1 promoter (een gen dat specifiek geïnduceerd in respons op Hog1 activiteit 8) de expressie van een viervoudige Venus fluorescerend eiwit (p STL1-qV) ontworpen. Flowcytometrie metingen ontdekt de aanwezigheid van twee populaties van cellen op intermediair spanningsniveau (0,1 M NaCl) met slechts een fractie van de populatie de expressie fluorescerende reporter. We gebruikten microscopie om dit gedrag verder te onderzoeken en ontdekte dat dit geluid in eiwit expressie werd bestuurd door intrinsieke factoren 9. We could verder zien dat cellen met een vergelijkbaar niveau van Hog1 activiteit opvallend verschillende uitkomsten uitdrukking konden geven. De combinatie van deze twee technieken konden we aantonen hoe de langzame verbouwing van stress respons genen van invloed op de expressie uitkomst op de enkele cel niveau 7.
In dit document gebruiken we de expressie van het p-STL1 qV reporter geïnduceerd door hyper-osmotische shock als voorbeeld van de kwantificering van eiwitexpressie door microscopie en flowcytometrie. Dezelfde stam blootgesteld aan 0,2 M NaCl spanning werd onderzocht met beide technieken. Dit zal ons toelaten om een aantal belangrijke verschillen in deze twee zeer complementaire technieken te markeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microscopie
De behandeling van het goed met ConA is een essentiële stap voor een goede beeldvorming van de cellen te waarborgen. Omdat ConA is slecht oplosbaar in PBS (5 mg / ml), het filtratieproces kan de verwijdering van grote aggregaten die in de ongefilterde oplossing zijn en storen de beeldvorming. Cellen hechten relatief sterk aan het behandelde oppervlak en de toevoeging van de inducerende oplossing niet de lokalisatie van de cellen te verstoren, waardoor een continu volgen voor en na …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken Matthias Peter en zijn groep aan het Instituut voor Biochemie aan de ETH in Zürich, waar deze methoden zijn ontwikkeld. Dit werk werd ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation.
Materials
| Reagent | |||
| Yeast Nitrogen Base | ForMedium | CYN6202 | |
| CSM amino-acid mix | ForMedium | DCS0011 | |
| Concanavalin A | GE Healthcare | 17-0450-01 | |
| Cycloheximide | Fluka Aldrich Sigma | C7698 | Toxic |
| ySP9 | W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus | ||
| pSP34 | pRS305 pSTL1 (-800 -0) – quadruple V enus | ||
| Material | |||
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | |
| Microscope control software | Micro-manager | Ver 1.4.11 | |
| Incubation chamber | LIS | The Box | |
| Fluorescence light source | Lumencor | SpectraX | |
| Camera | Hamamatsu | Flash 4.0 | |
| Flow cytometer | BD | FACS calibur | |
| Sonicator bath | Telesonic | TUC-150 | |
| 8-well-slide | Thermo Lab-tek | 155409 | |
| 96-well-plate | Matrical bioscience | MGB096-1-2-LG | |
| FACS tube | BD Falcon | 352054 |
References
- Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).
- de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes. Nature. 427 (6972), 370-374 (2004).
- Ghaemmaghami, S., Huh, W. -. K., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
- Wu, J. -. Q., Pollard, T. D. Counting cytokinesis proteins globally and locally in fission yeast. Science. 310 (5746), 310-314 (2005).
- Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
- Acar, M., Becskei, A., van Oudenaarden, A. Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions. Nature. 435 (7039), 228-232 (2005).
- Pelet, S., Rudolf, F., Nadal-Ribelles, M., de Nadal, E., Posas, F., Peter, M. Transient activation of the HOG MAPK pathway regulates bimodal gene expression. Science. 332 (6030), 732-735 (2011).
- de Nadal, E., Casadome, L., Posas, F. Targeting the MEF2-like transcription factor Smp1 by the stress-activated Hog1 mitogen-activated protein kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (1), 229-237 (2003).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
- Pelet, S., Dechant, R., Lee, S. S., van Drogen, F., Peter, M. An integrated image analysis platform to quantify signal transduction in single cells. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4 (10), 1274-1282 (2012).
- Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome biology. 7 (10), R100 (2006).
- Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry. Current protocols in molecular biology. Chapter 14, Unit 14.18 (2008).
- Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images. Current protocols in molecular biology. , (2012).
- Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 557-562 (2003).
- Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. Signal processing by the HOG MAP kinase pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (20), 7165-7170 (2008).
- Pepperkok, R., Ellenberg, J. High-throughput fluorescence microscopy for systems biology. Nature reviews Molecular cell biology. 7 (9), 690-696 (2006).
