Temporal Kvantificering af MAPK induceret ekspression i Single gærceller
Summary
To komplementære metoder baseret på flowcytometri og mikroskopi præsenteres som muligt at kvantificere, på enkelt celle niveau, af dynamikken i genekspression induceret ved aktivering af en MAPK-vejen i gær.
Abstract
Kvantificeringen af genekspression på enkelt celle niveau afdækker nye reguleringsmekanismer overstregede oplysninger i målinger på befolkningsniveau. To metoder baseret på mikroskopi og flowcytometri præsenteres for at vise, hvordan disse data kan erhverves. Ekspressionen af en fluorescerende reporter fremkaldt ved aktivering af den høje osmolaritet glycerol MAPK-vejen i gær anvendes som et eksempel. De specifikke fordele ved hver metode er fremhævet. Flowcytometri måler et stort antal celler (10.000) og tilvejebringer en direkte måling af dynamikken i protein-ekspression uafhængigt af de langsomme modningsformer kinetik af fluorescerende protein. Billeddannelse af levende celler ved mikroskopi er derimod begrænset til måling af modnet form af reporteren i færre celler. Datasæt genereret af denne teknik, kan dog være ekstremt rige takket være kombinationer af flere journalister, og til den rumlige og tidsmæssige informationopnået fra de enkelte celler. Kombinationen af disse to målemetoder kan levere nye indsigter om regulering af protein udtryk ved signalveje.
Introduction
Signalering via transduktion kaskader ofte kulminerer i ekspression af proteiner. Karakteriseringen af dette udtryk profil er et centralt element i at forstå funktionen af biologiske veje. Identifikationen af spektret af opregulerede proteiner og dynamikken i deres aktivering kan opnås ved forskellige teknikker, såsom mikro-arrays, northern blots eller western blots 1-3. Men gennemsnittet disse teknikker svaret af en hel population af celler. For at forstå den fine regulering af ekspression af proteiner, er det ønskeligt at samle målinger på enkelt celle niveau. Ideelt set bør disse målinger også give kvantitative data medgørlige at udvikle matematiske modeller af den underliggende vej.
Mikroskopi og flowcytometri er to teknikker, som er velegnet til at levere disse kvantitative encellede målinger. Den endogene mærkning af proteiner med et fluorescerende protein, kan be anvendes til at kvantificere deres udtryk niveau 4. , Da tilsætningen af en stor fluorescerende del på terminalen af proteinet kan gøre det ikke-funktionelle, er det ofte mere hensigtsmæssigt at skabe specifikke ekspressionssystemer reportere er baseret på en promotor, der driver ekspressionen af en fluorescerende konstruktion. Denne reporter protein er eksogen til den cellulære system, og derfor ikke indflydelse på signalering begivenheder, der finder sted i cellen.
Både mikroskopi og flowcytometri har været meget udbredt i gær felt signalering. Som eksempler; Colman-Lerner og kollegaer korreleret, i enkelte celler, udtryk for parring specifikke og konstitutivt udtrykt journalister ved mikroskopi at kvantificere støj i gær parring signaltransduktionskaskade 5, Acar og kolleger, der anvendes flowcytometri til at studere regulerende netværk kontrollerer ekspressionen af GAL generne 6. I en tidligere undersøgelse 7, har vi anvendt en kombinatiden af disse to teknikker til at studere ekspressionen output fra høj osmolaritet glycerol (HOG) pathway spirende gær. Denne mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK)-vej er udløst af hyper-osmotisk stress. Det resulterer i aktiveringen af MAPK Hog1, der translokerer til kernen af cellen til at fremkalde en transkriptionel program resulterer i ekspressionen af omkring 300 gener. For at undersøge denne proces, vi havde udviklet et udtryk reporter baseret på STL1 promotoren (et gen induceres specifikt i respons på Hog1 aktivitet 8), som driver ekspressionen af et firdobbelt Venus fluorescerende protein (p STL1-qV). Flowcytometri målinger afslørede tilstedeværelsen af to populationer af celler ved mellemliggende spændingsniveau (0,1 M NaCl), med kun en del af befolkningen, der udtrykker det fluorescerende reporter. Vi brugte mikroskopi for yderligere at undersøge denne adfærd, og opdagede, at denne støj i protein-ekspression blev styret af iboende faktorer 9. Vi could observere endvidere, at celler med et tilsvarende niveau for Hog1 aktivitet kunne vise påfaldende forskellige udtryk resultater. Kombinationen af disse to teknikker tilladt os at demonstrere, hvordan den langsomme ombygning af stress respons gener påvirket udtrykket resultat på enkelt celle niveau 7.
I dette papir, bruger vi udtrykket for p STL1-qV reporter induceret af hyper-osmotisk chok som et eksempel på kvantificering af protein-ekspression ved mikroskopi og flowcytometri. Den samme stamme underkastes 0,2 M NaCl stress blev undersøgt med begge teknikker. Dette vil give os mulighed for at fremhæve nogle af de vigtigste forskelle i disse to meget komplementære teknikker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microscopy
Behandlingen af brønden med ConA er et vigtigt skridt for at sikre en korrekt billeddannelse af cellerne. Fordi ConA har lav opløselighed i PBS (5 mg / ml), kan filtreringen fjernelse af store aggregater, der er til stede i det ufiltrerede opløsning og forstyrre billeddannelse. Celler vedhæfte forholdsvis kraftigt til den behandlede overflade, og tilsætningen af det inducerende opløsning bør ikke forstyrre lokalisering af cellerne, giver mulighed for en løbende ov…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Matthias Peter og hans gruppe på Institut for Biokemi på ETH i Zürich, hvor der er udviklet disse metoder. Dette arbejde er blevet støttet af den schweiziske National Science Foundation.
Materials
| Reagent | |||
| Yeast Nitrogen Base | ForMedium | CYN6202 | |
| CSM amino-acid mix | ForMedium | DCS0011 | |
| Concanavalin A | GE Healthcare | 17-0450-01 | |
| Cycloheximide | Fluka Aldrich Sigma | C7698 | Toxic |
| ySP9 | W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus | ||
| pSP34 | pRS305 pSTL1 (-800 -0) – quadruple V enus | ||
| Material | |||
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | |
| Microscope control software | Micro-manager | Ver 1.4.11 | |
| Incubation chamber | LIS | The Box | |
| Fluorescence light source | Lumencor | SpectraX | |
| Camera | Hamamatsu | Flash 4.0 | |
| Flow cytometer | BD | FACS calibur | |
| Sonicator bath | Telesonic | TUC-150 | |
| 8-well-slide | Thermo Lab-tek | 155409 | |
| 96-well-plate | Matrical bioscience | MGB096-1-2-LG | |
| FACS tube | BD Falcon | 352054 |
References
- Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).
- de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes. Nature. 427 (6972), 370-374 (2004).
- Ghaemmaghami, S., Huh, W. -. K., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
- Wu, J. -. Q., Pollard, T. D. Counting cytokinesis proteins globally and locally in fission yeast. Science. 310 (5746), 310-314 (2005).
- Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
- Acar, M., Becskei, A., van Oudenaarden, A. Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions. Nature. 435 (7039), 228-232 (2005).
- Pelet, S., Rudolf, F., Nadal-Ribelles, M., de Nadal, E., Posas, F., Peter, M. Transient activation of the HOG MAPK pathway regulates bimodal gene expression. Science. 332 (6030), 732-735 (2011).
- de Nadal, E., Casadome, L., Posas, F. Targeting the MEF2-like transcription factor Smp1 by the stress-activated Hog1 mitogen-activated protein kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (1), 229-237 (2003).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
- Pelet, S., Dechant, R., Lee, S. S., van Drogen, F., Peter, M. An integrated image analysis platform to quantify signal transduction in single cells. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4 (10), 1274-1282 (2012).
- Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome biology. 7 (10), R100 (2006).
- Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry. Current protocols in molecular biology. Chapter 14, Unit 14.18 (2008).
- Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images. Current protocols in molecular biology. , (2012).
- Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 557-562 (2003).
- Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. Signal processing by the HOG MAP kinase pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (20), 7165-7170 (2008).
- Pepperkok, R., Ellenberg, J. High-throughput fluorescence microscopy for systems biology. Nature reviews Molecular cell biology. 7 (9), 690-696 (2006).
