כימות זמניות של ביטוי MAPK מושרה בתאי שמרים יחיד
Summary
שתי שיטות משלימות המבוססות על הזרימה cytometry ומיקרוסקופיה מוצגות המאפשרות כימות, ברמת התא הבודד, של הדינמיקה של ביטוי גנים הנגרמת על ידי ההפעלה של מסלול MAPK בשמרים.
Abstract
כימות של ביטוי גנים ברמת התא הבודד חושפת מנגנוני ויסות רומן מטושטשים במדידות שבוצעו ברמת האוכלוסייה. שתי שיטות מבוססות על מיקרוסקופיה וcytometry זרימה מוצגות כדי להדגים כיצד ניתן לרכוש נתונים כאלה. הביטוי של כתב ניאון המושרה על שפעול מסלול MAPK גליצרול הגבוה osmolarity בשמרים משמש כדוגמא. היתרונות הספציפיים של כל שיטה מודגשים. Cytometry זרימה מודד מספר גדול של תאים (10,000) ומספק מדידה ישירה של הדינמיקה של ביטוי החלבון העצמאי של קינטיקה ההבשלה האיטית של חלבון פלואורסצנטי. הדמיה של תאי חיים על ידי מיקרוסקופ היא לעומת מוגבל למדידה של הטופס התבגר של הכתב בפחות תאים. עם זאת, ערכות נתונים שנוצרו על ידי טכניקה זו יכולה להיות עשיר מאוד הודות לשילובים של כתבים רבים ולמידע המרחב ובזמןהמתקבל מהתאים בודדים. שילוב של שתי שיטות מדידה אלה יכולים לספק תובנות חדשות על הרגולציה של ביטוי חלבון על ידי איתות מסלולים.
Introduction
איתות באמצעות מפלי התמרה לעתים קרובות מגיע לשיאו בביטוי של חלבונים. אפיון פרופיל ביטוי זה הוא מרכיב מפתח בהבנת התפקיד של מסלולים ביולוגיים. זיהוי של הספקטרום של חלבונים והדינמיקה של ההפעלה שלהם מוסדר עד יכול להיות מושגת על ידי טכניקות שונות, כגון מיקרו מערכים, כתמים הצפוניים או כתמים מערביים 1-3. עם זאת, טכניקות אלו הן בממוצע התגובה של אוכלוסייה שלמה של תאים. כדי להבין את הרגולציה הקנס של הביטוי של חלבונים, רצוי לאסוף מדידות ברמת התא בודדת. באופן אידיאלי, מדידות אלה אמורות גם לספק נתונים כמותיים נוחים לפתח מודלים מתמטיים של המסלול הבסיסי.
מיקרוסקופית וcytometry זרימה הן שתי טכניקות, שמתאימים באופן אידיאלי כדי לספק מדידות תא כזה כמותית אחת. תיוג אנדוגני של חלבונים בחלבון פלואורסצנטי יכול bדואר משמש לכמת רמת הביטוי שלהם 4. עם זאת, מאחר שהתוספת של מחצית ניאון גדולה בתחנה הסופית של החלבון יכולה להבהיר את זה שאינו פונקציונלי, הוא לעתים קרובות רצוי יותר כדי ליצור כתבי ביטוי ספציפיים המבוססים על אמרגן הנהיגה הביטוי למבנה ניאון. חלבון הכתב הזה הוא חיצוני למערכת הסלולרית, ולכן אינו משפיע על אירועי איתות המתרחשים בתא.
מיקרוסקופיה וcytometry זרימה שניהם הייתה בשימוש נרחב בתחום איתות השמרים. כדוגמאות; קולמן-לרנר ועמיתים לעבודה מתואמת, בתאים בודדים, הביטוי של הזדווגות כתבים ספציפיים והביעו constitutively על ידי מיקרוסקופ לכמת את הרעש במפל הולכים אותות שמרי הזדווגות 5, Acar ועמיתיו השתמשו cytometry זרימה ללמוד את רשת הרגולציה שליטה על הביטוי של גנים GAL 6. במחקר קודם 7, השתמשנו combinatiבשתי הטכניקות הללו כדי ללמוד את פלט הביטוי מגליצרול osmolarity הגבוה המסלול (HOG) בניצני שמרים. מסלול קינאז חלבון זה mitogen הופעל (MAPK) מופעל על ידי מתח Hyper-האוסמוטי. התוצאה הוא ההפעלה של Hog1 MAPK, אשר translocates לגרעין התא כדי לגרום לתכנית תעתיק וכתוצאה מכך הביטוי של בערך 300 גנים. ללמוד את התהליך הזה, היינו לנו מהונדס כתב ביטוי המבוסס על אמרגן STL1 (גן המושרה באופן ספציפי בתגובה לפעילות Hog1 8) נהיגה הביטוי של חלבון מרובע ונוס ניאון (עמ 'STL1-ע"ע). Cytometry זרימת מדידות חשפו את נוכחותם של שתי אוכלוסיות של תאים ברמה בינונית מתח (0.1 M NaCl) עם רק חלק קטן מהאוכלוסייה המבטאת את כתב הניאון. אנחנו השתמשנו במיקרוסקופ כדי לחקור את ההתנהגות הזאת עוד יותר וגילינו שהרעש הזה בביטוי חלבון היה נשלטת על ידי גורמים פנימיים 9. אנחנו could להתבונן עוד כי תאים עם רמה דומה של פעילות Hog1 יכולים להציג תוצאות ביטוי שונות לחלוטין. השילוב של שתי טכניקות אלה אפשר לנו להדגים כיצד שיפוץ האיטי של גנים תגובת לחץ השפיע על תוצאת הביטוי ברמת התא הבודד 7.
במאמר זה, אנו משתמשים בביטוי של כתב STL1-ע"ע עמ 'הנגרם על ידי הלם Hyper-האוסמוטי כדוגמא לכימות של ביטוי חלבון על ידי מיקרוסקופ וcytometry זרימה. אותו הזן נתון 0.2 מתח M NaCl נחקר בשני הטכניקות. זה יאפשר לנו להדגיש כמה הבדלים עיקריים בשתי טכניקות משלימות מאוד אלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מיקרוסקופית
הטיפול בהיטב עם ConA הוא צעד חיוני כדי להבטיח הדמיה תקינה של התאים. בגלל ConA יש מסיסות נמוכה ב PBS (5 מ"ג / מיליליטר), תהליך הסינון מאפשר הסרת אגרגטים גדולים שנמצאים בפתרון מסונן ולהפריע להדמיה. תאים לצרף יחסית חזק אל פני הש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים למתיאס פיטר וקבוצתו במכון לביוכימיה במכון הטכנולוגי בציריך שבו שיטות אלו פותחו. עבודה זו נתמכה על ידי שוויצרי הקרן הלאומית למדע.
Materials
| Reagent | |||
| Yeast Nitrogen Base | ForMedium | CYN6202 | |
| CSM amino-acid mix | ForMedium | DCS0011 | |
| Concanavalin A | GE Healthcare | 17-0450-01 | |
| Cycloheximide | Fluka Aldrich Sigma | C7698 | Toxic |
| ySP9 | W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus | ||
| pSP34 | pRS305 pSTL1 (-800 -0) – quadruple V enus | ||
| Material | |||
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | |
| Microscope control software | Micro-manager | Ver 1.4.11 | |
| Incubation chamber | LIS | The Box | |
| Fluorescence light source | Lumencor | SpectraX | |
| Camera | Hamamatsu | Flash 4.0 | |
| Flow cytometer | BD | FACS calibur | |
| Sonicator bath | Telesonic | TUC-150 | |
| 8-well-slide | Thermo Lab-tek | 155409 | |
| 96-well-plate | Matrical bioscience | MGB096-1-2-LG | |
| FACS tube | BD Falcon | 352054 |
References
- Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).
- de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes. Nature. 427 (6972), 370-374 (2004).
- Ghaemmaghami, S., Huh, W. -. K., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
- Wu, J. -. Q., Pollard, T. D. Counting cytokinesis proteins globally and locally in fission yeast. Science. 310 (5746), 310-314 (2005).
- Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
- Acar, M., Becskei, A., van Oudenaarden, A. Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions. Nature. 435 (7039), 228-232 (2005).
- Pelet, S., Rudolf, F., Nadal-Ribelles, M., de Nadal, E., Posas, F., Peter, M. Transient activation of the HOG MAPK pathway regulates bimodal gene expression. Science. 332 (6030), 732-735 (2011).
- de Nadal, E., Casadome, L., Posas, F. Targeting the MEF2-like transcription factor Smp1 by the stress-activated Hog1 mitogen-activated protein kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (1), 229-237 (2003).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
- Pelet, S., Dechant, R., Lee, S. S., van Drogen, F., Peter, M. An integrated image analysis platform to quantify signal transduction in single cells. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4 (10), 1274-1282 (2012).
- Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome biology. 7 (10), R100 (2006).
- Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry. Current protocols in molecular biology. Chapter 14, Unit 14.18 (2008).
- Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images. Current protocols in molecular biology. , (2012).
- Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 557-562 (2003).
- Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. Signal processing by the HOG MAP kinase pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (20), 7165-7170 (2008).
- Pepperkok, R., Ellenberg, J. High-throughput fluorescence microscopy for systems biology. Nature reviews Molecular cell biology. 7 (9), 690-696 (2006).
