एकल खमीर कोशिकाओं में MAPK प्रेरित अभिव्यक्ति की अस्थायी मात्रा
Summary
फ्लो और माइक्रोस्कोपी पर आधारित दो पूरक तरीकों खमीर में एक MAPK मार्ग की सक्रियता से प्रेरित जीन अभिव्यक्ति की गतिशीलता की एकल कोशिका के स्तर पर मात्रा का ठहराव, जो सक्षम प्रस्तुत कर रहे हैं.
Abstract
एकल कोशिका के स्तर पर जीन अभिव्यक्ति की मात्रा का ठहराव जनसंख्या के स्तर पर प्रदर्शन माप में छिप उपन्यास नियामक तंत्र uncovers. दो तरीकों माइक्रोस्कोपी पर आधारित है और प्रवाह cytometry इस तरह के डेटा का अधिग्रहण किया जा सकता है कि कैसे प्रदर्शित करने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं. खमीर में उच्च परासारिता ग्लिसरॉल MAPK मार्ग के सक्रियण पर प्रेरित एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की अभिव्यक्ति के लिए एक उदाहरण के रूप में प्रयोग किया जाता है. प्रत्येक विधि के विशिष्ट लाभ डाला जाता है. Cytometry कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या (10,000) उपायों और फ्लोरोसेंट प्रोटीन की धीमी परिपक्वता कैनेटीक्स की स्वतंत्र प्रोटीन अभिव्यक्ति की गतिशीलता का एक सीधा उपाय प्रदान प्रवाह. माइक्रोस्कोपी द्वारा जीवित कोशिकाओं की इमेजिंग कम कोशिकाओं में रिपोर्टर के परिपक्व फार्म की माप के लिए सीमित इसके विपरीत है. हालांकि, इस तकनीक द्वारा उत्पन्न डेटा सेट कई पत्रकारों का संयोजन करने के लिए और स्थानिक और लौकिक जानकारी के लिए अत्यंत समृद्ध धन्यवाद किया जा सकता हैव्यक्ति की कोशिकाओं से प्राप्त की. इन दो माप तरीकों का संयोजन संकेत दे रास्ते से प्रोटीन अभिव्यक्ति के नियमन पर नए अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं.
Introduction
पारगमन Cascades के माध्यम से संकेत अक्सर प्रोटीन की अभिव्यक्ति में खत्म. इस अभिव्यक्ति प्रोफाइल के लक्षण वर्णन जैविक रास्ते के समारोह को समझने में एक महत्वपूर्ण तत्व है. विनियमित प्रोटीन और उनके सक्रियण की गतिशीलता के स्पेक्ट्रम की पहचान ऐसे सूक्ष्म सरणियों, उत्तरी blots या पश्चिमी blots 1-3 के रूप में विभिन्न तकनीकों के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. हालांकि, इन तकनीकों कोशिकाओं की एक पूरी आबादी की प्रतिक्रिया औसत. प्रोटीन की अभिव्यक्ति के ठीक विनियमन समझने के लिए, यह एकल कोशिका के स्तर पर माप इकट्ठा करने के लिए वांछनीय है. आदर्श रूप में, इन मापों भी अंतर्निहित मार्ग के गणितीय मॉडल विकसित करने के लिए उत्तरदायी मात्रात्मक डेटा प्रदान करना चाहिए.
माइक्रोस्कोपी और फ्लो आदर्श मात्रात्मक एकल कक्ष माप देने के लिए अनुकूल हैं, जो दो तकनीकों हैं. एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ प्रोटीन की अंतर्जात टैगिंग कर सकते हैं खई उनकी अभिव्यक्ति के स्तर 4 यों इस्तेमाल किया. प्रोटीन की टर्मिनस पर एक बड़ा फ्लोरोसेंट आधा भाग के अलावा गैर कार्यात्मक इसे प्रस्तुत कर सकते हैं हालांकि, बाद से, यह एक फ्लोरोसेंट निर्माण की अभिव्यक्ति ड्राइविंग एक प्रमोटर के आधार पर विशिष्ट अभिव्यक्ति संवाददाताओं से उत्पन्न करने के लिए अक्सर अधिक वांछनीय है. इस संवाददाता प्रोटीन सेलुलर प्रणाली को एक्सोजेनस है और इसलिए सेल में जगह ले जा रहे हैं कि संकेत घटनाओं को प्रभावित नहीं करता है.
माइक्रोस्कोपी और प्रवाह cytometry दोनों व्यापक रूप से खमीर संकेतन क्षेत्र में इस्तेमाल किया गया है. उदाहरण के रूप में, Colman-लर्नर और सह कार्यकर्ता सहसंबद्ध, एकल कक्षों में, खमीर संभोग संकेत पारगमन झरना 5 में शोर यों तो माइक्रोस्कोपी द्वारा विशिष्ट और रचनात्मक रूप में व्यक्त संवाददाताओं से संभोग की अभिव्यक्ति, Acar और विनियामक नेटवर्क का अध्ययन करने के लिए प्रवाह cytometry इस्तेमाल किया सहयोगियों लड़की जीन 6 की अभिव्यक्ति को नियंत्रित. पिछले एक अध्ययन 7 में, हम एक combinati का इस्तेमाल किया हैउच्च परासारिता ग्लिसरॉल नवोदित खमीर में (हॉग) मार्ग से अभिव्यक्ति उत्पादन अध्ययन करने के लिए इन दो तकनीकों का पर. इस माइटोजन सक्रिय प्रोटीन kinase (MAPK) मार्ग अति आसमाटिक तनाव से शुरू हो रहा है. यह मोटे तौर पर 300 जीनों की अभिव्यक्ति में जिसके परिणामस्वरूप एक transcriptional कार्यक्रम को प्रेरित करने के लिए सेल के नाभिक को translocates जो MAPK Hog1, की सक्रियता का परिणाम है. इस प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए, हम एक चौगुनी वीनस फ्लोरोसेंट प्रोटीन (पी STL1-QV) की अभिव्यक्ति ड्राइविंग STL1 प्रमोटर (Hog1 गतिविधि 8 के जवाब में विशेष रूप से प्रेरित एक जीन) के आधार पर एक अभिव्यक्ति संवाददाता इंजीनियर था. माप फ्लोरोसेंट संवाददाता व्यक्त जनसंख्या का केवल एक अंश के साथ मध्यवर्ती तनाव स्तर (0.1 एम NaCl) में आबादी के दो कक्षों की उपस्थिति का पर्दाफाश प्रवाह cytometry. हम आगे इस व्यवहार की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया माइक्रोस्कोपी और प्रोटीन अभिव्यक्ति के इस शोर आंतरिक कारकों 9 द्वारा शासित था की खोज की. हम couएलडी आगे Hog1 गतिविधि का एक समान स्तर के साथ कोशिकाओं strikingly अलग अभिव्यक्ति के परिणामों को प्रदर्शित कर सकता है कि निरीक्षण करते हैं. इन दो तकनीकों का संयोजन हमें तनाव प्रतिक्रिया जीन की धीमी remodeling एकल कोशिका के स्तर 7 पर अभिव्यक्ति परिणाम प्रभावित कैसे प्रदर्शित करने की अनुमति दी.
इस पत्र में, हम माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति की मात्रा का ठहराव का एक उदाहरण के रूप में अति आसमाटिक सदमे से प्रेरित पी STL1-QV रिपोर्टर की अभिव्यक्ति का उपयोग करें और प्रवाह cytometry. 0.2 एम NaCl तनाव के अधीन ही तनाव दोनों तकनीकों के साथ अध्ययन किया गया था. यह हमें इन दो अत्यधिक पूरक तकनीक में कुछ महत्वपूर्ण मतभेदों को उजागर करने की अनुमति देगा.
Protocol
Representative Results
Discussion
माइक्रोस्कोपी
Cona के साथ अच्छी तरह से इलाज कोशिकाओं का एक उचित इमेजिंग सुनिश्चित करने के लिए एक आवश्यक कदम है. Cona पीबीएस (5 मिलीग्राम / एमएल) में कम विलेयता है क्योंकि, निस्पंदन प्रक्रिया की अनुमत…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों मथायस पीटर और इन तरीकों का विकास किया गया है, जहां पर ETH ज्यूरिख में जैव रसायन के संस्थान में उनके समूह को धन्यवाद. इस काम स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया है.
Materials
| Reagent | |||
| Yeast Nitrogen Base | ForMedium | CYN6202 | |
| CSM amino-acid mix | ForMedium | DCS0011 | |
| Concanavalin A | GE Healthcare | 17-0450-01 | |
| Cycloheximide | Fluka Aldrich Sigma | C7698 | Toxic |
| ySP9 | W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus | ||
| pSP34 | pRS305 pSTL1 (-800 -0) – quadruple V enus | ||
| Material | |||
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | |
| Microscope control software | Micro-manager | Ver 1.4.11 | |
| Incubation chamber | LIS | The Box | |
| Fluorescence light source | Lumencor | SpectraX | |
| Camera | Hamamatsu | Flash 4.0 | |
| Flow cytometer | BD | FACS calibur | |
| Sonicator bath | Telesonic | TUC-150 | |
| 8-well-slide | Thermo Lab-tek | 155409 | |
| 96-well-plate | Matrical bioscience | MGB096-1-2-LG | |
| FACS tube | BD Falcon | 352054 |
References
- Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).
- de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes. Nature. 427 (6972), 370-374 (2004).
- Ghaemmaghami, S., Huh, W. -. K., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
- Wu, J. -. Q., Pollard, T. D. Counting cytokinesis proteins globally and locally in fission yeast. Science. 310 (5746), 310-314 (2005).
- Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
- Acar, M., Becskei, A., van Oudenaarden, A. Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions. Nature. 435 (7039), 228-232 (2005).
- Pelet, S., Rudolf, F., Nadal-Ribelles, M., de Nadal, E., Posas, F., Peter, M. Transient activation of the HOG MAPK pathway regulates bimodal gene expression. Science. 332 (6030), 732-735 (2011).
- de Nadal, E., Casadome, L., Posas, F. Targeting the MEF2-like transcription factor Smp1 by the stress-activated Hog1 mitogen-activated protein kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (1), 229-237 (2003).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
- Pelet, S., Dechant, R., Lee, S. S., van Drogen, F., Peter, M. An integrated image analysis platform to quantify signal transduction in single cells. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4 (10), 1274-1282 (2012).
- Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome biology. 7 (10), R100 (2006).
- Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry. Current protocols in molecular biology. Chapter 14, Unit 14.18 (2008).
- Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images. Current protocols in molecular biology. , (2012).
- Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 557-562 (2003).
- Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. Signal processing by the HOG MAP kinase pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (20), 7165-7170 (2008).
- Pepperkok, R., Ellenberg, J. High-throughput fluorescence microscopy for systems biology. Nature reviews Molecular cell biology. 7 (9), 690-696 (2006).
