Summary
Transgene en knockout muismodellen van neurologische ziekten zijn bruikbaar voor het bestuderen van de rol van genen in normale en abnormale neurofysiologie. Dit artikel beschrijft methoden die kunnen worden gebruikt om lange termijn potentiëring, een cellulair mechanisme dat leren en geheugen ten grondslag kunnen liggen in transgene en knockout vrij gedragen muismodellen van neuropathologie bestuderen.
Abstract
Studies langdurige potentiëring van synaptische werkzaamheid, activiteit synaptische fenomeen met eigenschappen die het aantrekkelijk als potentiële cellulaire mechanisme onderliggende leren en informatieopslag maken, zijn lange tijd gebruikt om de fysiologie van verschillende neuronale circuits in de hippocampus, amygdala verduidelijken en andere limbische en corticale structuren. Met dit in gedachten, transgene muis modellen van neurologische aandoeningen vertegenwoordigen platforms die nuttig zijn om op lange termijn potentiëring (LTP) studies uitvoeren om een beter begrip van de rol van genen in normale en abnormale synaptische communicatie in neuronale netwerken die betrokken zijn bij het leren, emotie en informatie uit te verwerking. Dit artikel beschrijft methoden voor het betrouwbaar induceren LTP in de vrij gedragen muis. Deze methoden kunnen worden gebruikt in studies van transgene en knock-out vrij gedragen muismodellen van neurodegeneratieve ziekten.
Introduction
De ontwikkeling van de technologie om genen te manipuleren is geproduceerd transgene en knockout muismodellen bijna elke neurodegeneratieve en neurologische aandoeningen. Dit is de vertaling van elektrofysiologische onderzoekstechnieken eerder toegepast in grotere knaagdieren om de muis diermodel noodzakelijk. Een dergelijke neurofysiologische onderzoekstechniek is het lange-termijn potentiatie (LTP) om de werkzaamheid van synaptische verbindingen binnen neuronale netwerken op diverse neuropathologische aandoeningen testen. Dit protocol beschrijft technieken voor betrouwbare elektrofysiologische onderzoeken van LTP in vrij gedragen muizen. Het voordeel van dit protocol over anderen is dat het eenvoudig en gemakkelijk te implementeren, maar ook wat minder duur omdat het niet noch het gebruik van dure computergestuurde microdrive systemen of veldeffekttransistor headstages vereisen, en, voor zover wij weten, is de eerste video-protocol van chronische elektrofysiologische opnames to studeren LTP in vrij gedragen muizen. Daarom beschrijven we in dit artikel eenvoudige methoden voor het bestuderen lange termijn potentiëring in vrij gedragen muizen. Deze methodieken kunnen gemakkelijk worden vertaald naar transgene en knockout muismodellen van neuropathologische aandoeningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol is geschikt voor muizen van 3 en 18 maanden oud en de geschatte lichaamsgewicht van 30-50 g). Muizen kunnen worden verkregen bij The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Alle chirurgische en experimentele protocollen werden goedgekeurd door het Trinity College Animal Care en gebruik Comite en waren in overeenstemming met de NIH Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren.
1. Animal Voorbereiding en chirurgische ingrepen
- Bereid anesthesie cocktail met ketamine (25 mg / ml), xylazine (2,5 mg / ml) en acepromazine (0,5 mg / ml). Injecteer 1 ml / kg lichaamsgewicht in de rechter kwadrant van de buik aangevuld met 0,2 ml / kg injecties elke 45 minuten daarna een stabiele diepte van anesthesie met het pedaal terugtrekking reflex handhaven.
- Bereid verdoofde muis voor een operatie door het scheren van de vacht op haar schedel met behulp van een elektrisch scheerapparaat. Het geschoren gebied moet het midden van de ogen zijn naar het midden van de oren. Zorg ervoor dat de Whiske niet te scherenrs omdat ze deel uitmaken van de muis vat zintuig.
- Gebruik wattenstaafjes isopropylalcohol gevolgd door Betadine toepassing op het geschoren gebied op de weg. Dan, ook met wattenstaafjes, een kleine hoeveelheid minerale olie op de ogen te voorkomen dat de ogen uitdrogen.
- Gebruik baby rat oor manchetten in plaats van gewone oor bars aan het hoofd van het dier te monteren op de stereotaxisch frame apparaat. Om dit te doen, eerst zet het linker oor aan de linker oor manchet. Dan zachtjes gemak het rechter oor naar de rechter manchet door voorzichtig ondersteunen hoofd van het dier met een hand en het bevorderen van het oor manchet met de andere hand. Plaats vervolgens een verwarmingselement onder het lichaam van het dier en zet deze op 86 ° C om de lichaamstemperatuur te handhaven.
- Controleer vervolgens voor bilaterale stijfheid door te proberen om het hoofd opzij te verplaatsen naar de andere kant. Het dier correct gemonteerd op het stereotaxisch frame wanneer het hoofd stijf en kunnen niet worden verplaatst zijdelings maar kan gemakkelijk draaien op en neer.
- Voorzichtig rust demuis snuit op de neus / tand bar assemblage ervoor te zorgen dat de snijtanden voorzichtig maar stevig rusten binnen de tand opening van de neus / tand bar.
- Met behulp van een steriel scalpel een middellijn incisie vanaf het midden van het oog naar het midden van de oren. Zorg ervoor dat de scalpel wordt gehouden in een hoek van 45 ° en voldoende druk door de onderliggende fascia, maar niet om dwars door de schedel als die overmatig bloeden veroorzaken van toepassing.
- Gebruik wattenstaafjes om de fascia scheiden en de schedel bloot te leggen. Oriëntatiepunten schedel bregma en lambda moet duidelijk zichtbaar (figuur 1A) zijn. Zorg ervoor dat het dier in de schedel vlakke positie door het aanpassen van de neus / tand bar zodanig dat bregma en lambda bezienswaardigheden zijn op hetzelfde de dorsoventral (DV) positie (+ 0,1 mm).
- Breng een kleine hoeveelheid steriele zoutoplossing om het blootgestelde gebied en gebruik wattenstaafjes om voorzichtig reinigen van de schedel. Wacht dan 2-3 min voor de schedel volledig de lucht drogenvoordat u verder gaat.
- Monteer een naald aan de linkerkant stereotaxisch arm naar de DV positie van bregma en lambda meten. De DV plaats van deze twee monumenten moet binnen 0,1 mm van elkaar. Zo niet, kan de neus bar van het stereotaxisch frame worden ingesteld op en neer om dit te bereiken.
- Plaats de naald op bregma zijn anterior-posterior (AP), laterale (LAT) en dorsoventral (DV) metingen te registreren. Zorg ervoor dat de naald net raakt de schedel en niet doordringen.
- Gebruik een muizenhersenen atlas, zoals "muizenhersenen in stereotaxische coördinaten" 1, de coördinaten van de doelstructuren bepalen: mediale perforant pathway (MPP) in de hoekige bundel en dentate gyrus (DG) van de hippocampus opzichte van lambda en bregma, respectievelijk (zie ook tabel 1). Dan, met een fijne balpen of potlood om deze punten te markeren op de schedel.
- Ook markeren twee punten aan de contralaterale zijde van de schedel. Deze punten which zal dienen als aarde (GND) en referentie (REF) moet ongeveer 3 mm van de middellijn en gepositioneerd in langsrichting ten opzichte van elkaar (figuur 1A, ook tabel 1).
- Verwijder de naald marker van links stereotactische arm en te vervangen door een elektrische tandartsboor uitgerust met een stereotaxisch mount. Plaats de boor over elk gemarkeerd punt en maak kleine gaten boren van ongeveer 0,5 mm in diameter. Bij het boren, gebruik dan een repetitieve up-en-neer beweging en controleer regelmatig of de boor de schedel is doorgedrongen tot de hersenen oppervlak bloot te leggen.
- Voorzichtig maar stevig een schroef elektrode rijden (# 0-80 1/8 in roestvrij staal machine schroeven, sleuven Cilinderschroef) in elk van de contralaterale gaten (GND en REF), zodanig dat ze net de corticale oppervlak aanraken zonder penetreren (figuur 1A ). Deze twee schroef elektroden dienen als ondergrond en referentie.
- Mount stimulerende en registrerende elektroden in electrode houders aan de linker en rechter stereotaxische armen.
- Sluit de stimulerende elektrode terminals een elektrofysiologische stimulator met stroomisolatie en de registratie-elektrode terminal een elektrofysiologische differentiële versterker (winst = 1000, banddoorlaatfilter = 1 Hz-3 kHz) en vervolgens naar een digitale oscilloscoop voor visuele inspectie van reacties van de consument. Sluit ook GND en REF elektrodeklemmen de differentiële versterker.
- Voorzichtig en langzaam lager zowel stimulerend en registrerende elektroden in stappen van 0,5 mm en visueel toezicht op de opgewekte reactie op een stimulus schok van 600-800 uA. Blijf elke elektrode verlagen totdat ze hun doel DV positie te bereiken en een stereotiepe signaal wordt waargenomen op de oscilloscoop (Figuur 1B).
- Daarna gebruiken tandheelkundige acryl cement om een pet te maken om de elektrode terminals in zijn plaats te houden, een tandheelkundige cement dat de huid raakt zou moeten worden geveegdonmiddellijk. Zodra het tandheelkundig cement volledig uitgehard overdragen dier uit de stereotaxische frame aan een schone knaagdier kooi. Gebruik een warmtelamp of pad om de kerntemperatuur te behouden.
- Bewaak het dier elk uur tot het weer bij bewustzijn. Een injectie van flunixine kunnen worden toegediend als analgeticum.
2. LTP Inductie
- Laat het dier 5-7 dagen om te herstellen van een operatie. Plaats het dier in de opname-omgeving bestaande uit een kooi van Faraday (122 cm x 43 cm x 43 cm) voorzien van geluidsisolatie materiaal en een 5-kanaals roterende commutator het aansluiten van de elektrode leidt tot de stimulerende / recording setup.
- Laat het dier om te acclimatiseren voor 1-2 uur in de opname-omgeving voordat u de elektroden met de stimulerende en registratie-instrumenten (zie stap 1.17).
- Stel de stimulator controles uitgang 400 uA en noteer de amplitude van gemiddeld 10 opgewekte responsen voor dat eop ten minste 10 seconden verlopen tussen stimuli. Met de in figuur 1C methode om de opgeroepen respons te kwantificeren. Herhaal deze procedure voor 600, 800, 1.000, 1.200 en 1.400 uA.
- Construct een invoer / uitvoer kromme door het uitzetten van de gemiddelde amplitude van de opgewekte respons versus stimulus intensiteit. Uit deze grafiek bepalen stimulus intensiteit die overeenkomt met 50% van de maximale amplitude gemeten. Gebruik de intensiteit van 50% voor de rest van het experiment.
- Vervolgens worden met 50% stimulusintensiteit verkrijgen basislijn door het opnemen van de gemiddelde amplitude van 5 opgewekte responsen elke minuut gedurende 15 minuten. Nogmaals ervoor te zorgen dat ten minste 10 seconden verstrijken tussen stimuli.
- Vervolgens leveren de tetanische stimulatie bestaat uit 10 uitbarstingen van 10 pulsen bij 400 Hz met een burst rate van 5 Hz tot de mediale perforant pad. Bewaak het dier nauw op tekenen van aanvallen, waaronder natte hond shakes. Als het dier een aanval de experiment moet worden beëindigd en alle gegevens van die dieren moeten van de studieresultaten worden uitgesloten.
- Dan blijven registreren de gemiddelde amplitude van 5 reacties van de consument elke minuut gedurende 30 minuten posttetanization. Daarna vergelijk amplitude aan de basislijn amplitude in stap 2.5 verkregen door berekening van de procentuele verandering van basislijn (figuur 2).
- Na de afsluiting van experimenten, wordt het dier gedood door middel van inhalatie van isofluraan-een methode die in overeenstemming is met de richtsnoeren inzake euthanasie van de American Veterinary Medical Association.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tabel 1 geeft de coördinaten voor DG en MPP zoals gebruikt in dit protocol Figuur 1A toont de opschriften op de doelstructuren op de schedel,.. Eveneens getoond zijn de locatie van de grond en referentie-elektroden Figuur 1B illustreert representatieve opgewekte reacties sporen zowel pre- en posttetanization in hetzelfde dier. Merk op dat de posttetanization opgewekte respons groter is dan de pretetanization antwoord dat indicatief is voor LTP-inductie 2. Figuur 1C illustreert de wijze waarop de responsamplitude kwantificeren. Inderdaad, Figuur 2 toont het percentage verandering in responsamplitude over een tijdsverloop verspreid zowel pre-en posttetanization perioden. Er moet worden opgemerkt dat de piek LTP waarden dan 100%. Deze resultaten van een verbeterde respons amplitude volgende tetanization geven aan dat dit protocol succesvol en dus betrouwbaar is voor het bestuderen van LTP isin de vrij gedragen muismodel.
Tabel 1. Coördinaten voor doelstructuren. Anterior-posterior (AP) coördineert voor dentate gyrus (DG) en REF worden gegeven ten opzichte van bregma terwijl die voor mediale perforant pad (MPP) en GND zijn ten opzichte van Lambda. Alle DV coördinaten ten opzichte van het corticale oppervlak onder dura.
Figuur 1. Elektrode locatie en representatief sporen van de opgeroepen respons. A) Schematische illustratie van de relatieve locatie van elektroden op de muis skuII. B) Typische sporen van de opgewekte reacties zowel pre-en posttetanization. C) algoritme gebruikt om de amplitude van de opgewekte reacties te kwantificeren.
Figuur 2. LTP in de mediale perforant pad-dentate gyrus synaps. Vertegenwoordiger gevolg van LTP inductie in mPP-DG synaps van een vrij te gedragen muis. Opmerking posttetanic stimulatie versterking van de evoked response amplitude indicatief voor LTP inductie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol hebben we een betrouwbare en eenvoudige methode voor het bestuderen LTP DG in vrij gedragen muizen aangetoond. Terwijl veel studies van LTP in wakkere ratten zijn uitgevoerd 3,4 hebben zeer weinig uitgevoerd in wakkere muizen vooral te danken aan de technische complexiteit veroorzaakt door de beperkte craniale vastgoed in muizen en het gewicht van de elektrode headstages ten opzichte van het gemiddelde gewicht van muizen 5. De weinige studies die LTP in DG hebben aangetoond in vrij gedragen muizen gebruikt ofwel microdrive elektrodesystemen of knooppunt field-effect transistor (JFET) voorversterkers geïntegreerd in de headstage die noodzakelijkerwijs bijdraagt aan de elektrode lading last voor het dier 6-10. De betekenis van het huidige protocol is dat het een verbetering is ten opzichte van bestaande methoden voor het induceren van LTP in de DG in vrij gedraagt muizen als het vermijdt het gebruik van microdrive elektrode systemen of een headstage JFET's.
Het is belangrijktant aan de kritische stappen van deze protocol benadrukken. Deze omvatten: 1) bevestiging van het hoofd van de muis in de stereotaxisch frame zodanig dat het bilateraal stijf (deze stap kan de meest moeilijk zijn omdat het vereist oefening en kennis van de techniek), 2) optimale positionering van de elektroden respons omvang maximaliseren kan worden verbeterd door het verzekeren dat bregma en lambda zijn in hetzelfde vlak dat gewoonlijk kan worden bereikt door de stereotaxisch frame tandstang, zodanig dat het verschil in dorsoventral positionering van bregma en lambda niet groter is dan 0,1 mm, 3) tijdens de opnamefase van het experiment, is het aanbevolen dat de dieren de tijd krijgen om te wennen aan de opname-omgeving, omdat de nieuwigheid van de opname-omgeving schommelingen kunnen insinueren in de evoked response gegevens verzameld; 4) een geschikte keuze van de elektroden zal signaalkwaliteit en trouw te verbeteren: bipolaire elektroden ( RVS onderhuidse buis met 0,2 mm RVSdraad insert met een tip scheiding van 0,5 mm) hebben de voorkeur voor het stimuleren tijdens monopolaire elektroden (-epoxylite geïsoleerde enkelstrengs wolfraamdraad) worden gebruikt voor het opnemen van zenuwweefsel, en 5) muizen worden verdoofd met een intraperitoneale injectie van een mengsel van ketamine (25 mg / ml), xylazine (2,5 mg / ml) en acepromazine (0,5 mg / ml). Deze verdoving mengsel moet vervolgens worden toegediend in een dosering van 1ml/kg die meestal effectief in ongeveer 20 minuten aangevuld met 0,2 ml / kg elke 45 min een stabiele diepte van de anesthesie te handhaven.
Er zijn een paar beperkingen van dit protocol dat dragen vermelden. Dit protocol heeft geen inzicht op ionkanaal mechanismen of receptor eiwitsynthese die kunnen gebaat LTP geven. Daarom weinig informatie beschikbaar over de werkelijke aantallen van neuronen in de bevolking wordt opgenomen. Een andere beperking is dat sinds opgewekte responsen worden verzameld door wakkere dieren moeilijk te ascertain en ontleden het effect van factoren zoals stress, handling of vervuiling van het opgenomen signaal door valse sensomotorische activiteit. Deze beperkingen kunnen worden overwonnen door ervoor te zorgen dat de reacties van de consument alleen worden geregistreerd wanneer het dier is de inactieve maar alerte staat, ook wel bekend als de stille waakzaamheid wakende toestand.
Toch is de in dit protocol beschreven technieken zorgen voor de meest fysiologisch relevante platform voor het onderzoeken van de hersenen elektrische activiteit onderliggende gedrag. Naar aanleiding van de stappen in dit protocol, kan elke hersenstructuur worden gericht op het gebruik van de juiste coördinaten zoals gegeven door een atlas van de hersenen van muizen 1. Het is belangrijk op te merken dat de volwassen rat stereotactische frame kan worden in muizen mits geschikte baby rat oor manchetten worden gebruikt in plaats van de reguliere oor bars. Het oor manchetten zal het hoofd immobiliseren zonder beschadiging oren van de muis. Ten slotte kan de methoden hier gepresenteerde readil zijny vertaald naar elektrofysiologische onderzoeken in transgene en knockout muismodellen van een groot aantal neurologische aandoeningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen de volgende erkennen: Dr Joseph Bronzino, Dr Khamis Abu-Hassaballah, de heer RJ Austin-LaFrance, en mevrouw Jessica Koranda.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (100 mg/ml) | Henry Schein | 10177 | |
| Xylazine (20 mg/ml) | Henry Schein | 33197 | |
| Acepromazine (10 mg/ml) | Henry Schein | 2177 | |
| Dental acrylic powder | Lang Dental Manufacturing Co. | 1330CLR | |
| Dental acrylic liquid | Lang Dental Manufacturing Co. | 1306CLR | |
| Tungsten wire (0.127 mm) | World Precision Instruments | TGW0515 | |
| Stainless Steel Hypodermic Tubing (0.286 mm) | World Precision Instruments | 832400 | |
| Flunixin (50 mg/ml) | Henry Schein | 14165 | |
| Epoxilyte | Superior Essex | EP 6001-M | |
| Stainless steel wire insert (0.2 mm) | World Precision Instruments | 792900 | |
| Stereotaxic frame apparatus | Kopf Instruments | Model 902 | |
| Ear cuffs (ear cups) | Kopf Instruments | Model 921 | |
| Electrophysiological stimulator | Astro-Med, Inc. | S88 | |
| Digital oscilloscope | B K Precision Corp. | 2542 | |
| Current isolation unit | Astro-Med, Inc. | PSIU-6 | |
| Differential amplifier | World Precision Instruments, Inc. | DAM-50 | |
| Commutator | Plastics One | SLC6 | |
| Dental drill | Stoelting | 58650 |
References
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Compact 2nd edn, Elsevier Academic Press. (2004).
- Bliss, T. V. P., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J. Physiol. 232, 331-356 (1973).
- Blaise, J. H., Bronzino, J. D. Effects of stimulus frequency and age on bidirectional synaptic plasticity in the dentate gyrus of freely moving rats. Exp. Neurol. 182, 497-506 (2003).
- Blaise, J. H., Koranda, J. L., Chow, U., Haines, K. E., Dorward, E. C. Neonatal isolation stress alters bidirectional long-term synaptic plasticity in amygdalo-hippocampal synapses in freely behaving adult rats. Brain Res. 1193, 25-33 (2008).
- Koranda, J. L., Masino, S. A., Blaise, J. H. Bidirectional synaptic plasticity in the dentate gyrus of the awake freely behaving mouse. J. Neurosci. Methods. 167, 160-166 (2008).
- Cooke, S. F., et al. Autophosphorylation of alphaCaMKII is not a general requirement for NMDA receptor-dependent LTP in the adult mouse. J. Physiol. 574, 805-818 (2006).
- Davis, S., Bliss, T. V., Dutrieux, G., Laroche, S., Errington, M. L. Induction and duration of long-term potentiation in the hippocampus of the freely moving mouse. J. Neurosci. Methods. 75, 75-80 (1997).
- Jones, M. W., Peckham, H. M., Errington, M. L., Bliss, T. V., Routtenberg, A. Synaptic plasticity in the hippocampus of awake C57BL/6 and DBA/2 mice: interstrain differences and parallels with behavior. Hippocampus. 11, 391-396 (2001).
- Zhang, T. A., Tang, J., Pidoplichko, V. I., Dani, J. A. Addictive nicotine alters local circuit inhibition during the induction of in vivo hippocampal synaptic potentiation. J. Neurosci. 30, 6443-6453 (2010).
- Tang, J., Dani, J. A. Dopamine enables in vivo synaptic plasticity associated with the addictive drug nicotine. Neuron. 63, 673-682 (2009).
