I saggi di redditività per le cellule in coltura

Summary

Composti terapeutici sono spesso prima esaminate in vitro con saggi di vitalità. Conta delle cellule cieche da un osservatore umano può essere molto sensibile alle piccole variazioni di numero di cellulare, ma non valutare la funzione. Test di vitalità computerizzati, come qui descritto, in grado di valutare sia la struttura e la funzione in modo obiettivo.

Abstract

Conta delle cellule manuali su un microscopio sono un mezzo sensibile per valutare la vitalità cellulare, ma sono in termini di tempo e quindi costoso. Test di vitalità computerizzati sono costose in termini di attrezzature, ma può essere più veloce e più obiettivo di conta delle cellule manuali. La presente relazione descrive l'uso di tre di questi test di vitalità. Due di questi saggi sono infrarossi e uno è luminescente. Entrambi i saggi infrarossi si basano su un Imager Odyssey 16 bit. Un saggio infrarossi utilizza la macchia DRAQ5 per nuclei combinati con la macchia zaffiro per citosol e viene visualizzato nel canale 700 nm. L'altra analisi a raggi infrarossi, un In-Cell occidentale, utilizza anticorpi contro le proteine ​​del citoscheletro (α-tubulina o microtubuli proteina associata 2) e le etichette nel canale 800 nm. Il terzo saggio vitalità è un saggio luminescente comunemente usato per ATP, ma usiamo un quarto del volume consigliato di risparmiare sui costi. Queste misurazioni sono affatto lineare e correlazione con il numero di ceLLS placcato, ma variano in sensibilità. Tutti e tre saggi eludere microscopio che richiede tempo e assaggiare l'intero bene, riducendo errore di campionamento. Infine, tutti i saggi possono facilmente essere completata entro un giorno della fine dell'esperimento, consentendo un maggior numero di esperimenti da eseguire entro brevi tempi. Tuttavia, tutti si basano sul presupposto che il numero di cellule rimangono in proporzione alla potenza del segnale dopo il trattamento, un presupposto che a volte non viene soddisfatta, soprattutto per ATP cellulare. Inoltre, se le cellule aumentano o diminuiscono in dimensioni dopo il trattamento, questo potrebbe influenzare la potenza del segnale senza compromettere numero di cellulare. Concludiamo che tutti i saggi di redditività, inclusi i conteggi manuali, risentono di una serie di avvertimenti, ma che i test di vitalità informatici sono ben merita l'investimento iniziale. Utilizzando tutti e tre saggi insieme produce una visione completa della struttura e della funzione cellulare.

Introduction

Il saggio vitalità più comune nelle scienze biologiche comporta la conta delle cellule. Ciò è dimostrato da un'analisi delle superiori (più recenti) 200 pubblicazioni apparse in PubMed sia con le parole chiave "in vitro" o "cultura" a 2013/04/29 e 2013/04/30. Di queste pubblicazioni, il 23,5% utilizzati saggi di conta delle cellule, compresi i manuali numero di cellulare conteggi, numero di cellulare automatizzata conta con il software di imaging, e Trypan esclusione blu. Il / dosaggio Morto Live è stato usato in 1% di queste pubblicazioni. Il numero di pubblicazioni che utilizzano il MTT (3 – (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromuro) test per la vitalità metabolica era l'11%. Questa rassegna della letteratura mostra anche che il numero di pubblicazioni usando saggi come MTT in combinazione con saggi conteggio cellulare era solo 3,5%. Nonostante la tendenza ad utilizzare un dosaggio vitalità di per sé, la valutazione della funzione cellulare in associazione con il numero di cellule sembra la scelta migliore per valutare i cellularintegrity. Conta delle cellule da soli non sono sufficienti perché le cellule rimanenti non possono essere funzionali o sani anche se sono presenti nel pozzo ^1,2. Viceversa, misure funzionali quali ATP possono aumentare o diminuire in assenza di variazioni parallele nel numero di cellule. Il disaccoppiamento di letture metaboliche da numero di cellulare suggerisce che ATP e MTT test non dovrebbero mai essere utilizzati come unico saggio di redditività. Nella presente relazione, tre saggi di vitalità che il sondaggio sia le strutture cellulari e funzione metabolica sono descritti, per una visione più completa della integrità cellulare di qualsiasi test di per sé può permettersi.

Due dei nostri saggi richiedono un Termovisore che misura la fluorescenza nei canali 700 e 800 nm. Il rumore è basso nelle lunghezze d'onda infrarosse, portando a maggiori rapporti ³ segnale-rumore. L'imager Odissea che usiamo ha una gamma dinamica 4,5 log e un po 'profondità di 16, Translating di 2 ¹⁶ o 65.536 tonalità di infrarossi. Questo può essere contrapposta a immagini a colori a 8 bit, che offre solo 2 ⁸ o 256 tonalità di colore per ogni lunghezza d'onda. Così, a 16 bit di imaging ha una risoluzione più fine. Va notato che le immagini infrarosse originali vengono pseudocolored verde (800 nm) e rosso (700 nm) in rapporti pubblicati per la presentazione. Imager Odyssey sono comunemente utilizzati sia per Western blotting e In-Cell western ^4-7. In-Cell western sulle cellule formaldeide-fisso utilizzano anticorpi primari contro qualsiasi proteina di interesse ed etichettarli in giro con anticorpi secondari fluorescenti a raggi infrarossi. Questa tecnica è nota per essere particolarmente utile per gli endpoint fosforilazione ^6. Nella nostra In-Cell western, abbiamo macchiare cellule fissate per le proteine ​​del citoscheletro α-tubulina o microtubuli neuronali proteina associata 2 (MAP2) nel canale 800 nm. Queste proteine ​​sono abbastanza abbondanti per produrre elevati rapporti segnale-rumore. Abbiamo anche macchiare i nostri piatti in 700canale nm per nuclei con la macchia DRAQ5 e per il citoplasma con la macchia zaffiro. Entrambe le proteine ​​del citoscheletro e le DRAQ5 + macchie Sapphire riflettono quindi le strutture cellulari.

Il terzo saggio di redditività misura la funzione metabolica e si chiama "Cell Titer Glo." In questo saggio basato luciferasi-, valori di luminescenza sono direttamente proporzionali ai livelli di ATP. Saggi ATP sono comunemente usati per quantificare cellule vitali ^8-12. Tuttavia, compresa la parola "titolo" nel nome del saggio è un termine improprio perché ATP uscita per cella può cambiare in funzione di trattamenti tossina e quindi non è sempre proporzionale al numero di cellule ^8. Livelli di ATP possono anche essere influenzati da ritmi circadiani ¹³ e ¹⁴ la divisione cellulare e la differenziazione cellulare ^15. Tuttavia, il saggio ATP mostrato qui è semplice da eseguire e utile perché ATP è una misura robusta metabolicaredditività ^16-21, se non cellulare il numero di per sé. Usando questo test per completare l'infrarosso In-Cell western cede quindi un quadro più completo della integrità cellulare di qualsiasi saggio da solo.

Protocol

Uno schema dei protocolli è illustrato in Figura 1. 1. Cella di placcatura Cellule piastra in piastre da 96 pozzetti a diverse densità di placcatura (Figura 2). Per i controlli di linearità sulla linea cellulare di neuroblastoma N2a, piatto 2.5k, 5k, 10k e 15k cellule per pozzetto in 3 o 6 pozzetti / gruppo. Per i controlli di linearità di ratto neuroni corticali primarie, piatto 25k, 50k, 100k, 200k e cellule per pozzetto in 3…

Representative Results

Il fattore limitante in questi esperimenti è la colorazione infrarossi, come il saggio ATP è relativamente breve durata. Per i saggi infrarossi, anticipiamo che otto piastre da 96 pozzetti possono essere colorati e scansione entro un giorno incredibile cifra di due lotti di quattro piastre ciascuno (vedi Figura 1). Questa stima assume 20 min di fissazione, 30 min di lavaggio, 30 min di blocco, 2 ore di incubazione anticorpo primario seguita da 30 minuti di lavaggi, 1 ora di incubazione anticorpo secon…

Discussion

Abbiamo scoperto che la potenza del segnale in tutte e tre saggi di vitalità è lineare e correlazione con la densità di placcatura. Tuttavia, non tutti i saggi sono ugualmente sensibili a 2 volte o cambiamenti di 1,5 volte in densità di placcatura. Per le cellule N2a, i saggi infrarossi sono meno sensibili di dosaggio ATP, particolarmente a basse densità di placcatura. Sebbene i saggi infrarossi sono meno sensibili di ATP, i DRAQ5 + zaffiro saggi e saggi α-tubulina sono in buon accordo in che rivelano l'impatt…

Materials

Cell Titer Glo	Promega	G7572	Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks
18% Formalin	Thermo-Shandon	9990244	Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells
Odyssey Block	LI-COR	927-40003	This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	21568	We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C
Sodium Phosphate Monobasic	Fisher	S468	One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher	S373	See above
Sodium Azide (250x)	Ricca Chemical Company	7144.8-16	Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris
Mouse anti-α-tubulin	Sigma-Aldrich	T5168	This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific
Mouse anti-MAP2	Sigma-Aldrich	M9942	This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns)
800 nm Goat anti-mouse IgG	LI-COR	926-32210	Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source
DRAQ5	Biostatus	DR50200	This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM
Sapphire	LI-COR	928-40022
Luminometer	PerkinElmer	VICTOR3 1420 multilabel counter
Odyssey Imager	LI-COR	9201-01
Shaker/Mixer	Research Products International	248555