Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l'integrazione Synaptic
Summary
In questo articolo introduciamo veloce micro-ionoforesi di neurotrasmettitori come tecnica per studiare l'integrazione di segnali post-sinaptici con elevata precisione spaziale e temporale.
Abstract
Uno degli interessi fondamentali nel campo delle neuroscienze è quello di comprendere l'integrazione di input eccitatori e inibitori lungo il molto complessa struttura dell'albero dendritico, che finisce per produzione neuronale di potenziali d'azione presso l'assone. L'influenza dei diversi parametri spaziali e temporali di specifica ingresso sinaptica neuronale in uscita è attualmente sotto inchiesta, ad esempio, la distanza di attenuazione in funzione degli ingressi dendritiche, l'interazione dipendente dalla posizione degli ingressi spazialmente segregati, l'influenza di inibizione GABAergig sull'integrazione eccitatorio, lineare e le modalità di integrazione non lineari, e molti altri.
Con rapido micro-ionoforesi di glutammato e GABA è possibile indagare con precisione la integrazione spaziale e temporale di eccitazione e di inibizione GABAergica glutammatergica. Requisiti tecnici critici sono o una lampada fluorescente triggered, diodi emettitori di luce (LED), o di un due fotoni SCAnning microscopio per visualizzare rami dendritici senza introdurre significative foto-danneggiamento del tessuto. Inoltre, è molto importante avere un amplificatore micro-ionoforesi che permette la rapida compensazione capacitanza di pipette ad alta resistenza. Un altro punto cruciale è che nessun trasmettitore è involontariamente rilasciato dalla pipetta durante l'esperimento.
Una volta stabilito, questa tecnica darà segnali affidabili e riproducibili con un alto neurotrasmettitore e la posizione specificità. Rispetto al glutammato e GABA uncaging, ionoforesi veloce permette utilizzando entrambi i trasmettitori contemporaneamente ma in luoghi molto distanti senza limitazione al campo di vista. Ci sono anche vantaggi rispetto alla focale stimolazione elettrica degli assoni: con micro-ionoforesi la posizione del sito di ingresso sicuramente noto ed è sicuro che solo il neurotrasmettitore di interesse viene rilasciato. Tuttavia è da considerare solo quest'ultimo con il micro-ionoforesipostsynapse si attiva e aspetti presinaptico del rilascio di neurotrasmettitori non sono risolti. In questo articolo mostriamo come configurare micro-ionoforesi in esperimenti fetta del cervello.
Introduction
Neuroni nel sistema nervoso centrale ricevono una varietà di input sinaptici sul loro processi dendritici sottili e ramificate 1. Lì, la maggioranza degli ingressi eccitatori dendritiche sono mediate da sinapsi glutamatergiche. Queste sinapsi possono essere attivati in modo spazialmente distribuito, con conseguente integrazione lineare postsinaptica dei potenziali post-sinaptici eccitatori (EPSPs). Se le sinapsi vengono attivati contemporaneamente e in prossimità spaziale sul dendrite, questi ingressi eccitatori possono essere integrati sovra-lineare e generano picchi dendritica 2-5.
Inoltre, l'integrazione di ingressi eccitatori dipende dalla posizione dell'ingresso sull'albero dendritico. I segnali che arrivano alla regione ciuffo distale sono molto più attenuate rispetto ingressi prossimale a causa di filtraggio cavo 6. Nell'ippocampo, ingressi lontane verso le dendriti apicali ciuffo sono generati da una regione del cervello differente rispetto a quelli su prossimale dendriTES 7. Una domanda interessante è quindi, come ingresso sinaptica viene elaborato da diversi compartimenti dendritici e se l'integrazione dendritica regola l'influenza di questi ingressi a strati su neuronale in modi diversi.
Non solo le proprietà funzionali, le caratteristiche morfologiche del dendrite, la posizione e il clustering degli ingressi stanno interessando l'integrazione dendritica di input eccitatori, anche gli ingressi inibitori aggiuntivi da terminali GABAergici cruciale determinare l'efficacia delle sinapsi glutamatergiche 8,9. Questi diversi aspetti dell'integrazione sinaptica possono essere idealmente studiati usando neurotrasmettitore micro-ionoforesi, che permette l'applicazione spazialmente definita di diversi neurotrasmettitori a domini dendritiche. Dimostriamo qui come stabilire con successo micro-ionoforesi di glutammato e GABA per indagare l'integrazione del segnale nei neuroni.
Per questa applicazione, a punta finealta resistenza pipette riempite con soluzioni concentrate neurotrasmettitori vengono utilizzati. Queste pipette sono posizionati vicino alla membrana esterna della cellula, dove si trovano i recettori dei neurotrasmettitori. È necessaria una buona visualizzazione dei rami dendritici. Ciò si ottiene utilizzando coloranti fluorescenti, che vengono introdotti attraverso la pipetta di patch. Poi un brevissimo (<1 msec) impulso di corrente (nell'intervallo di 10-100 nA) viene utilizzata per espellere le molecole del neurotrasmettitore cariche. Con queste brevi impulsi rapidi ed efficaci alle capacità, potenziali post-sinaptici o correnti possono essere evocate con alta precisione temporale e spaziale, il che significa che la posizione del input eccitatorio sia noto con precisione. Glutammato micro-ionoforesi può attivare sinapsi in un raggio definito, che è più piccolo di 6 ìm come qui mostrato (Figura 1 9), ma è anche possibile raggiungere sola risoluzione sinapsi 10-12.
Heine, M., et al </em> mostrato che la risoluzione spaziale di fast micro-ionoforesi può anche essere regolata per individuare dimensioni inferiori a 0.5 micron, che è più piccolo di dimensioni dei punti regolarmente conseguiti con uncaging due fotoni di glutammato 13. Con la veloce micro-ionoforesi è facilmente possibile utilizzare due o più pipette iontoforesi e metterli a diversi punti, anche lontani sull'albero dendritico. In questo modo, l'integrazione di eventi eccitatori, compresi quelli di differenti vie, può essere indagato. È anche possibile utilizzare un glutammato e GABA una pipetta riempita Iontoforetico contemporaneamente. In questo modo l'effetto di inibizione GABAergica in luoghi diversi relativi all'ingresso di eccitatorio (on-path, off-path inibizione) può essere studiato. Inoltre, l'impatto della inibizione da interneuroni di targeting specifici domini neuronali, come dendriti distali, soma o assoni 14, può essere indagato mediante ionoforesi GABA. In neuroni in coltura, veloce micro-ionoforesi offre l'opportunità di investigate distribuzione sinapsi singolo e gli aspetti elementari della comunicazione sinaptica in neuroni in modo molto più dettagliato 10,11.
In questo articolo si dimostra in dettaglio come stabilire ionoforesi glutammato e GABA per l'uso in fettine di cervello acuto, che permette di indagare l'integrazione sinaptica degli input eccitatori e inibitori in dipendenza della posizione di ingresso, i punti di forza di input, e la tempistica, da soli o in interazione. Noi evidenziare i vantaggi ei limiti di questa tecnica e su come risolvere i problemi con successo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui spieghiamo come applicare velocemente micro-ionoforesi di neurotrasmettitori per indagare l'integrazione sinaptica su dendriti. Questa tecnica è stata utilizzata con successo per indagare trasmissione sinaptica glutamatergica e GABAergica in differenti regioni cerebrali in vitro e in vivo 9,20-22. Micro-ionoforesi è stato utilizzato per più di 60 anni, ma nei primi anni è stato in gran parte utilizzato per applicare sia a livello locale neurotrasmettitori e farmaci su tempi lenti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Hans Reiner Polder, Martin Fuhrmann e Walker Jackson per aver letto con attenzione il manoscritto. Gli autori hanno ricevuto finanziamenti che è stato fornito dal Ministero della Ricerca MIWF dello stato Nord Reno-Westfalia (SR), il BMBF-Projekträger DLR collaborazione USA-tedesco in neuroscienze computazionali (CRCNS, SR), Centri di Eccellenza nelle malattie neurodegenerative (COEN; SR), e l'Università di Bonn programma di finanziamento intramurale (BONFOR; SR).
Materials
| Material | |||
| Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | ||
| Two-photon laser scanning microscope Ultima IV | Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA | ||
| Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser | Chameleon Ultra II, Coherent | ||
| 60X Objective, NA 0.9 | Olympus | ||
| Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Monochromator | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Micro-iontophoresis system MVCS-02 | NPI Electronics, Tamm, Germany | ||
| Sutter puller P-97 | Sutter Instrument Company, Novato, CA | ||
| Glass filaments (150 GB F 8P) | Science Products, Hofheim, Germany | ||
| Reagent | |||
| Alexa Fluor 488 hydrazide | Molecular Probes life technologies | A-10436 | |
| Alexa Fluor 594 | Molecular Probes life technologies | A-10438 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6297 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5080 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| K-Gluconate | Sigma Aldrich | G4500 | |
| HEPES-acid | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Phosphocreatin | Sigma Aldrich | P7936 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Glutamic acid | Sigma Aldrich | G8415 | |
| GABA | Sigma Aldrich | A5835 | |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | |
| HCl | Merck | 1.09108.1000 |
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