Summary

Derivando o Curso momento do desembaraço glutamato com uma Análise de Deconvolução das correntes Transporter astrocitárias

Published: August 07, 2013
doi:

Summary

Nós descrevemos um método analítico para estimar o tempo de vida de glutamato em membranas astrocitários de registros eletrofisiológicos de correntes transportador de glutamato em astrócitos.

Abstract

A maior densidade de transportadores de glutamato no cérebro é encontrada em astrócitos. O glutamato transportadores acoplar o movimento de glutamato através da membrana com o co-transporte de Na + e 3 1 de H + e a contra-transporte de K + 1. A corrente estequiométrica gerado pelo processo de transporte pode ser monitorizado com gravações de célula inteira de patch-clamp de astrócitos. O curso de tempo da corrente registada é moldada por o curso de tempo do perfil de concentração de glutamato que astrócitos são expostas, a cinética de transportadores de glutamato, e as propriedades das membranas passivas electrotonic astrocíticos. Aqui, descrevemos os métodos experimentais e analíticos que podem ser utilizados para registar as correntes do transportador de glutamato em astrócitos e isolar o curso de tempo de recarga glutamato de todos os outros factores que moldam a forma de onda das correntes de transportador astrocíticos. Os métodos descritos aqui podem ser usados ​​para estimar o tempo de vida of flash-uncaged e glutamato sinapticamente lançado em membranas astrocitários em qualquer região do sistema nervoso central durante a saúde ea doença.

Introduction

Os astrócitos são um dos tipos de célula mais abundante no cérebro com uma morfologia em forma de estrela e as saliências de membranas finas que se estendem ao longo do neuropil e alcançar vizinha contactos sinápticos 1,2. Membrana celular dos astrócitos é densamente embalado com moléculas transportador de glutamato 3. Sob condições fisiológicas, os transportadores de glutamato rapidamente ligar glutamato no lado extracelular da membrana e transferi-lo para o citoplasma da célula. Ao fazer isso, os transportadores mantêm a concentração basal baixa de glutamato no espaço extracelular 4. Transportadores de glutamato em finas processos astrocitários adjacentes sinapses excitatórias são idealmente posicionado para ligar glutamato liberado durante eventos sinápticos, pois difunde para longe da fenda sináptica. Ao fazer isso, os transportadores também limitar spillover glutamato para peri e regiões extra-sinápticos e em sinapses vizinhas, reduzindo a propagação espacial do sinal excitatórios no cérebro 5-7.

Transporte do glutamato é um processo eletrogênica estequiometricamente acoplado ao movimento de 3 Na + e H + 1 ao longo do seu gradiente electroquimico e ao contra-transporte de K + 1 8. Transporte de glutamato está associado (mas não estequiometricamente acoplado a) uma condutância aniônica permeável ao SCN (tiocianato)> NO 3 (nitrato) ≈ ClO 4 (perclorato)> I -> Br -> Cl -> F -, não a CH 3 SO 3 (metano-sulfonato), C 6 H 11 O 7 (gluconato) 9-11. Ambas as correntes (estequiométrica e não-estequiométrico) podem ser gravados pela obtenção de gravações de patch-clamp de célula inteira de astrócitos, identificados visualmente sob iluminação Dodt ou infra-vermelho contraste de interferência diferencial (IR-DIC), em Agudode e fatias de cérebro 12. O componente estequiométrica da corrente associado com o transporte do glutamato através da membrana pode ser isolado utilizando CH 3 SO 3 ou C 6 H 11 O 7 soluções intracelulares base e pode ser evocada por glutamato flash uncaging em astrócitos 13,14, ou ativando a liberação de glutamato de sinapses vizinhas, tanto eletricamente 12 ou com um controle optogenetic alvo.

O decurso de tempo do componente estequiométrica do transportador de corrente é formada por toda a vida do perfil de concentração de glutamato na astrocíticos membranas (isto é, passe glutamato), a cinética de transportadores de glutamato, as propriedades de astrócitos membrana passiva, e durante estimulações sinápticos, pela sincronia de liberação de glutamato através das sinapses ativadas 13. Aqui vamos descrever em detalhes: (1) uma aprox experimentaloach para isolar o componente estequiométrica de correntes de transportador de glutamato a partir de células inteiras gravações de patch-clamp de astrócitos de rato utilizando fatias de hipocampo agudas como por exemplo a preparação experimental, (2) uma abordagem analítica para derivar o tempo de curso do apuramento glutamato destas gravações 13, 14. Estes métodos podem ser usados ​​para registar e analisar as correntes do transportador de glutamato a partir de astrócitos em qualquer região do sistema nervoso central.

Protocol

1. Slice Preparação Prepare uma solução de 500 ml de corte / armazenamento contendo (em mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 de CaCl2, 1,3 MgSO4 · 7H 2 O, 4 MgCl2, 26,2 NaHCO3, 1 NaH 2 PO 4, e 22 de glucose, 320 mOsm, pH 7,4 Usar um copo de 250 ml para preparar uma câmara de imersão para as fatias, encher com 200 ml de solução de cortar / armazenamento, aquecê-lo num banho de água a 34 ° C e borbulhar com 95% de</su…

Representative Results

O êxito da abordagem analítica descrita aqui criticamente dependente da obtenção de registos electrofisiolicos de alta qualidade a partir de correntes de transportador astrócitos em qualquer região do sistema nervoso central. Em fatias do hipocampo do rato agudas, os astrócitos podem ser prontamente identificados em Dodt iluminação ou IR-DIC, pois o corpo de célula pequena (Ø = 10 mm) e núcleo proeminente (Figura 1). A sua morfologia distinta em forma de estrela podem ser apreciados com epif…

Discussion

Descrevemos aqui uma abordagem experimental para obter registos electrofisiolicos de astrócitos, um protocolo de análise para isolar as correntes do transportador de glutamato em astrócitos e um método matemático para derivar o curso de tempo de depuração a partir das correntes do transportador de glutamato astrocíticos.

O sucesso da análise baseia-se na capacidade de obter alta qualidade gravações de patch clamp de astrócitos e na precisão dos algoritmos de montagem utilizadas …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Doenças Neurológicas e programa de pesquisa intramuros Curso (NS002986). AS escreveu o manuscrito e implementada a análise de deconvolução. JSD desenvolveu a versão inicial da análise de deconvolução e comentou sobre o texto.

Materials

Material Name Company Catalogue Number Comments
CGP52432 Tocris 1246
(R,S)-CPP Tocris 173
DPCPX Tocris 439
LY341495 disodium salt Tocris 4062
MSOP Tocris 803
NBQX disodium salt Tocris 1044
D,L-TBOA Tocis 1223
Picrotoxin Sigma P1675
MNI-L-glutamate Tocris 1490
Alexa 594 Life Technologies A10438 Optional
Matrix electrodes Frederick Haer Company MX21AES(JD3)
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments PG10165-4
Dual-stage glass micro-pipette puller Narishige PC-10
Loctite 404 instant adhesive Ted Pella 46551
Xe lamp Rapp OptoElectronic FlashMic
Igor Pro 6 Wavemetrics

References

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Cite This Article
Scimemi, A., Diamond, J. S. Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents. J. Vis. Exp. (78), e50708, doi:10.3791/50708 (2013).

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