Derivando o Curso momento do desembaraço glutamato com uma Análise de Deconvolução das correntes Transporter astrocitárias
Summary
Nós descrevemos um método analítico para estimar o tempo de vida de glutamato em membranas astrocitários de registros eletrofisiológicos de correntes transportador de glutamato em astrócitos.
Abstract
A maior densidade de transportadores de glutamato no cérebro é encontrada em astrócitos. O glutamato transportadores acoplar o movimento de glutamato através da membrana com o co-transporte de Na + e 3 1 de H + e a contra-transporte de K + 1. A corrente estequiométrica gerado pelo processo de transporte pode ser monitorizado com gravações de célula inteira de patch-clamp de astrócitos. O curso de tempo da corrente registada é moldada por o curso de tempo do perfil de concentração de glutamato que astrócitos são expostas, a cinética de transportadores de glutamato, e as propriedades das membranas passivas electrotonic astrocíticos. Aqui, descrevemos os métodos experimentais e analíticos que podem ser utilizados para registar as correntes do transportador de glutamato em astrócitos e isolar o curso de tempo de recarga glutamato de todos os outros factores que moldam a forma de onda das correntes de transportador astrocíticos. Os métodos descritos aqui podem ser usados para estimar o tempo de vida of flash-uncaged e glutamato sinapticamente lançado em membranas astrocitários em qualquer região do sistema nervoso central durante a saúde ea doença.
Introduction
Os astrócitos são um dos tipos de célula mais abundante no cérebro com uma morfologia em forma de estrela e as saliências de membranas finas que se estendem ao longo do neuropil e alcançar vizinha contactos sinápticos 1,2. Membrana celular dos astrócitos é densamente embalado com moléculas transportador de glutamato 3. Sob condições fisiológicas, os transportadores de glutamato rapidamente ligar glutamato no lado extracelular da membrana e transferi-lo para o citoplasma da célula. Ao fazer isso, os transportadores mantêm a concentração basal baixa de glutamato no espaço extracelular 4. Transportadores de glutamato em finas processos astrocitários adjacentes sinapses excitatórias são idealmente posicionado para ligar glutamato liberado durante eventos sinápticos, pois difunde para longe da fenda sináptica. Ao fazer isso, os transportadores também limitar spillover glutamato para peri e regiões extra-sinápticos e em sinapses vizinhas, reduzindo a propagação espacial do sinal excitatórios no cérebro 5-7.
Transporte do glutamato é um processo eletrogênica estequiometricamente acoplado ao movimento de 3 Na + e H + 1 ao longo do seu gradiente electroquimico e ao contra-transporte de K + 1 8. Transporte de glutamato está associado (mas não estequiometricamente acoplado a) uma condutância aniônica permeável ao SCN – (tiocianato)> NO 3 – (nitrato) ≈ ClO 4 – (perclorato)> I -> Br -> Cl -> F -, não a CH 3 SO 3 – (metano-sulfonato), C 6 H 11 O 7 – (gluconato) 9-11. Ambas as correntes (estequiométrica e não-estequiométrico) podem ser gravados pela obtenção de gravações de patch-clamp de célula inteira de astrócitos, identificados visualmente sob iluminação Dodt ou infra-vermelho contraste de interferência diferencial (IR-DIC), em Agudode e fatias de cérebro 12. O componente estequiométrica da corrente associado com o transporte do glutamato através da membrana pode ser isolado utilizando CH 3 SO 3 – ou C 6 H 11 O 7 – soluções intracelulares base e pode ser evocada por glutamato flash uncaging em astrócitos 13,14, ou ativando a liberação de glutamato de sinapses vizinhas, tanto eletricamente 12 ou com um controle optogenetic alvo.
O decurso de tempo do componente estequiométrica do transportador de corrente é formada por toda a vida do perfil de concentração de glutamato na astrocíticos membranas (isto é, passe glutamato), a cinética de transportadores de glutamato, as propriedades de astrócitos membrana passiva, e durante estimulações sinápticos, pela sincronia de liberação de glutamato através das sinapses ativadas 13. Aqui vamos descrever em detalhes: (1) uma aprox experimentaloach para isolar o componente estequiométrica de correntes de transportador de glutamato a partir de células inteiras gravações de patch-clamp de astrócitos de rato utilizando fatias de hipocampo agudas como por exemplo a preparação experimental, (2) uma abordagem analítica para derivar o tempo de curso do apuramento glutamato destas gravações 13, 14. Estes métodos podem ser usados para registar e analisar as correntes do transportador de glutamato a partir de astrócitos em qualquer região do sistema nervoso central.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descrevemos aqui uma abordagem experimental para obter registos electrofisiolicos de astrócitos, um protocolo de análise para isolar as correntes do transportador de glutamato em astrócitos e um método matemático para derivar o curso de tempo de depuração a partir das correntes do transportador de glutamato astrocíticos.
O sucesso da análise baseia-se na capacidade de obter alta qualidade gravações de patch clamp de astrócitos e na precisão dos algoritmos de montagem utilizadas …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Doenças Neurológicas e programa de pesquisa intramuros Curso (NS002986). AS escreveu o manuscrito e implementada a análise de deconvolução. JSD desenvolveu a versão inicial da análise de deconvolução e comentou sobre o texto.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| CGP52432 | Tocris | 1246 | |
| (R,S)-CPP | Tocris | 173 | |
| DPCPX | Tocris | 439 | |
| LY341495 disodium salt | Tocris | 4062 | |
| MSOP | Tocris | 803 | |
| NBQX disodium salt | Tocris | 1044 | |
| D,L-TBOA | Tocis | 1223 | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| MNI-L-glutamate | Tocris | 1490 | |
| Alexa 594 | Life Technologies | A10438 | Optional |
| Matrix electrodes | Frederick Haer Company | MX21AES(JD3) | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | PG10165-4 | |
| Dual-stage glass micro-pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Loctite 404 instant adhesive | Ted Pella | 46551 | |
| Xe lamp | Rapp OptoElectronic | FlashMic | |
| Igor Pro 6 | Wavemetrics |
References
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