Härledning tidsförloppet för Glutamat Räkenskapsavslutning en Deconvolution Analys av astrocytisk Transporter Currents
Summary
Vi beskriver en analysmetod för att uppskatta livslängden för glutamat vid astrocytiska membran från elektrofysiologiska inspelningar av glutamat transportör strömmar i astrocyter.
Abstract
Den högsta tätheten av glutamat transportörer i hjärnan finns i astrocyter. Glutamat transportörer par rörelse glutamat över membranet med co-transport av 3 Na + och 1 H + och disk-transport av 1 K +. Den stökiometriska ström som genereras av transporter kan övervakas med hel-cell patch-clamp inspelningar från astrocyter. Tidsförloppet för den inspelade strömmen formas av tidsförloppet av glutamat koncentration profilen som astrocyter utsätts, kinetiken av glutamat transportörer, och de passiva electrotonic egenskaper astrocytic membran. Här beskriver vi de experimentella och analytiska metoder som kan användas för att spela in glutamat transportör strömmar i astrocyter och isolera tidsförloppet för glutamat godkännande från alla andra faktorer som formar vågformen av astrocytiska transportör strömmar. De metoder som beskrivs här kan användas för att uppskatta livstid of flash-uncaged och synaptically-utsläppt glutamat vid astrocytiska membran i varje region i centrala nervsystemet vid hälsa och sjukdom.
Introduction
Astrocytes är en av de mest förekommande celltyper i hjärnan med stjärnformade morfologi och fina utsprång membran som sträcker sig genom hela neuropil och nå angränsande synaptic kontakter 1,2. De astrocyter 'cellmembranet är tätt packat med glutamat transportör molekyler 3. Under fysiologiska förhållanden, glutamat transportörer binder snabbt glutamat på den extracellulära sidan av membranet och överföra den till cellens cytoplasma. Genom att göra så, transportörerna upprätthålla låg den basala koncentrationen av glutamat i det extracellulära rummet 4. Glutamat transportörer i fina astrocytiska processer intill retande synapser är idealiskt positionerade för att binda glutamat frigörs under synaptiska händelser som den diffunderar bort från den synaptiska spalten. Genom att göra så, transportörerna begränsar också glutamat spillover mot peri-och extra-synaptiska regioner och på angränsande synapser, minskar den rumsliga spridningen av excitatoriska signalerer i hjärnan 5-7.
Glutamat transporter är en electrogenic process stökiometriskt kopplad till rörelsen av 3 Na + och 1 H + längs sin elektrokemiska gradient och disk-transport av en K + 8. Glutamat transporter förknippas med (men inte stökiometriskt kopplad till) en anjonisk konduktans genomsläpplig för SCN – (tiocyanat)> NO 3 – (nitrat) ≈ CIO 4 – (klorat)> I -> Br -> Cl -> F -, inte till CH 3 SO 3 – (metansulfonat) och C 6 H 11 O 7 – (glukonat) 9-11. Båda strömmar (stökiometrisk och icke-stökiometrisk) kan spelas in genom att erhålla hel-cell patch-clamp inspelningar från astrocyter, visuellt identifierats enligt Dodt belysning eller infrarött differential interferens kontrast (IR-DIC) i Acute hjärnsnitt 12. Den stökiometriska komponenten i den nuvarande förknippas med glutamat transport över membranet kan isoleras med hjälp av CH 3 SO 3 – eller C 6 H 11 O 7 – baserade intracellulära lösningar och kan framkallas av flash-uncaging glutamat på astrocyter 13,14, eller genom att aktivera glutamatfrisättning från angränsande synapser, antingen elektriskt 12 eller med en riktad optogenetic kontroll.
Tidsförloppet för den stökiometriska komponenten av transportören strömmen formas av livslängden för glutamat koncentrationsprofilen på astrocytiska membran (dvs. glutamat clearance), kinetik glutamat transportörer, de passiva membran egenskaper astrocyter, och under synaptiska stimulering, vid synchronicity av glutamatfrisättning över de aktiverade synapser 13. Här beskriver vi i detalj: (1) en experimentell caoach att isolera den stökiometriska komponenten av glutamat transportör strömmar från hela-cell patch-clamp inspelningar från astrocyter med akut mus hippocampus skivor som exempel experimentell beredning, (2) ett analytiskt tillvägagångssätt att härleda tidsförloppet av glutamat clearance från dessa inspelningar 13 14. Dessa metoder kan användas för att registrera och analysera glutamat transportör strömmar från astrocyter i varje region i det centrala nervsystemet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi en experimentell metod för att få elektrofysiologiska inspelningar från astrocyter, en analytisk protokoll för att isolera glutamat transportör strömmar i astrocyter och en matematisk metod för att härleda tidsförloppet av glutamat clearance från astrocytiska transportör strömmar.
Framgången av analysen bygger på förmågan att erhålla högkvalitativa inspelningar patch clamp från astrocyter och om riktigheten av de passande algoritmer som används för att …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institute of neurologiska sjukdomar och stroke Interna forskningsprogram (NS002986). AS skrev manus och genomfört deconvolution analysen. JSD utvecklade den första versionen av deconvolution analys och kommenterade texten.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| CGP52432 | Tocris | 1246 | |
| (R,S)-CPP | Tocris | 173 | |
| DPCPX | Tocris | 439 | |
| LY341495 disodium salt | Tocris | 4062 | |
| MSOP | Tocris | 803 | |
| NBQX disodium salt | Tocris | 1044 | |
| D,L-TBOA | Tocis | 1223 | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| MNI-L-glutamate | Tocris | 1490 | |
| Alexa 594 | Life Technologies | A10438 | Optional |
| Matrix electrodes | Frederick Haer Company | MX21AES(JD3) | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | PG10165-4 | |
| Dual-stage glass micro-pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Loctite 404 instant adhesive | Ted Pella | 46551 | |
| Xe lamp | Rapp OptoElectronic | FlashMic | |
| Igor Pro 6 | Wavemetrics |
References
- Ventura, R., Harris, K. M. Three-dimensional relationships between hippocampal synapses and astrocytes. J. Neurosci. 19, 6897-6906 (1999).
- Witcher, M. R., Kirov, S. A., Harris, K. M. Plasticity of perisynaptic astroglia during synaptogenesis in the mature rat hippocampus. Glia. 55, 13-23 (2007).
- Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
- Herman, M. A., Jahr, C. E. Extracellular glutamate concentration in hippocampal slice. J. Neurosci. 27, 9736-9741 (2007).
- Arnth-Jensen, N., Jabaudon, D., Scanziani, M. Cooperation between independent hippocampal synapses is controlled by glutamate uptake. Nat. Neurosci. 5, 325-331 (2002).
- Barbour, B. An evaluation of synapse independence. J. Neurosci. 21, 7969-7984 (2001).
- Rusakov, D. A., Kullmann, D. M. Extrasynaptic glutamate diffusion in the hippocampus: ultrastructural constraints, uptake, and receptor activation. J. Neurosci. 18, 3158-3170 (1998).
- Zerangue, N., Kavanaugh, M. P. Flux coupling in a neuronal glutamate transporter. Nature. 383, 634-637 (1038).
- Eliasof, S., Jahr, C. E. Retinal glial cell glutamate transporter is coupled to an anionic conductance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 4153-4158 (1996).
- Wadiche, J. I., Amara, S. G., Kavanaugh, M. P. Ion fluxes associated with excitatory amino acid transport. Neuron. 15, 721-728 (1995).
- Wadiche, J. I., Kavanaugh, M. P. Macroscopic and microscopic properties of a cloned glutamate transporter/chloride channel. J. Neurosci. 18, 7650-7661 (1998).
- Bergles, D. E., Jahr, C. E. Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes. Neuron. 19, 1297-1308 (1997).
- Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J. Neurosci. 25, 2906-2916 (2005).
- Scimemi, A., Tian, H. Neuronal transporters regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus. J. Neurosci. 29, 14581-14595 (2009).
- Zuo, Z. Isoflurane enhances glutamate uptake via glutamate transporters in rat glial cells. Neuroreport. 12, 1077-1080 (2001).
- Barbour, B., Brew, H., Attwell, D. Electrogenic uptake of glutamate and aspartate into glial cells isolated from the salamander (Ambystoma) retina. J. Physiol. 436, 169-193 (1991).
- Bergles, D. E., Tzingounis, A. V., Jahr, C. E. Comparison of coupled and uncoupled currents during glutamate uptake by GLT-1 transporters. J. Neurosci. 22, 10153-10162 (2002).
- Diamond, J. S., Jahr, C. E. Synaptically released glutamate does not overwhelm transporters on hippocampal astrocytes during high-frequency stimulation. J. Neurophysiol. 83, 2835-2843 (2000).
- Benediktsson, A. M., et al. Neuronal activity regulates glutamate transporter dynamics in developing astrocytes. Glia. 60, 175-188 (2012).
- Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4411-4416 (2008).
- Scimemi, A., Meabon, J., Woltjer, R. L., Sullivan, J. M., Diamond, J. S., Cook, D. G. Amyloidβ1-42 slows clearance of synaptically-released glutamate by mislocalizing astrocytic GLT-1. J. Neurosci. 33, 5312-5318 (2013).
