Astrositik Transporter Akımlar bir Dekonvolüsyon Analizi ile Glutamat Gümrükleme gün Dersin türetilmesi
Summary
Biz astrositlerde glutamat taşıyıcı akımların elektrofizyolojik kayıtları astrositik membranların de glutamat ömrünü tahmin etmek için analitik bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Beyinde glutamat taşıyıcıları en yüksek yoğunluğu astrositlerde bulunmuştur. 3 Na +, 1 H, CO-kamyonu + ve 1 K karşı taşıma zarından glutamat glutamat taşıyıcılarının çift hareket +. Taşıma işlemi tarafından oluşturulan stoikiometrik mevcut astrositlerden tam hücre patch-clamp kayıtları ile izlenebilir. Kaydedilen akımın zaman ders astrositler maruz kaldığı glutamat konsantrasyonu profil, glutamat taşıyıcı kinetiği ve astrositik membranların pasif elektrotonik özelliklerinin zaman ders şekillenir. Burada astrositlerde glutamat taşıyıcı akımları kaydetmek ve astrositik taşıyıcı akımların dalga şekli tüm diğer faktörlerden glutamat açıklık zaman ders izole etmek için kullanılabilecek deneysel ve analitik yöntemleri açıklar. Burada açıklanan yöntemlerle kullanım süresi o tahmin etmek için de kullanılabilirf flash Uncaged ve sağlık ve hastalık sırasında merkezi sinir sisteminin herhangi bir bölgesinde astrositik membranlar de glutamat synaptically-yayınladı.
Introduction
Astrositler yıldız şeklinde morfolojisi ve nöropil boyunca uzanır ve komşu sinaptik iletişim 1,2 ulaşmak, ince zar çıkıntıları olan beyinde en bol hücre tipleri vardır. Astrositler 'hücre zarı yoğun glutamat taşıyıcı moleküllerin 3 ile doludur. Fizyolojik koşullar altında, glutamat taşıyıcıları hızla zarın hücre dışı glutamat tarafında bağlanır ve hücre sitoplazması aktarın. Böyle yaparak, nakil dışı alan 4 glutamat düşük bazal konsantrasyonu korumak. Sinaps eksitatör bitişik ince astrositik süreçlerinde glutamat taşıyıcılarının ideal uzak sinaptik yarık gelen yayılır olarak sinaptik olaylar sırasında serbest glutamat bağlamak için konumlandırılmış. Böyle yaparak, taşıyıcılar da uyarıcı sinyal mekansal yayılmasının azaltılmasında, peri-ve ekstra-sinaptik bölgelere doğru ve komşu sinaps üzerine glutamat yayılma sınırı5-7 beyinde n.
Glutamat taşıma stokiyometrik 3 hareketine bağlı olan bir süreçtir Elektrojenik Na + ve 1H bunların elektrokimyasal gradyan boyunca + K + 1 ve 8 arasında karşı taşıma. (Tiyosiyanat)> NO – 3 – (nitrat) ≈ Cıo 4 – (perklorat)> I -> Br -> Cl -> F – değil, glutamat taşıma SCN geçirgen (ancak stokiyometrik olarak birleştirilmiş olmayan) anyonik bir iletkenlik ile ilişkili (metan sülfonat) ve C 6 H 11 O 7 – – (glukonat) 9-11 CH 3 SO 3. Her iki akımları (stokiyometrik ve olmayan stokiyometrik) görsel olarak akut olarak Dodt aydınlatma veya kızılötesi diferansiyel girişim kontrast (IR-DIC) kapsamında belirlenen astrositlerden, gelen tam hücreli yama-kelepçe kayıtları alarak kaydedilebilirE beyin dilimleri 12. Zarından glutamat taşıma ile ilişkili geçerli stoikiometrik bileşeni CH3 SO 3 kullanılarak izole edilebilir – ya da C 6H 11 O – 7 dayalı hücre içi solüsyon ve astrositler 13,14 üzerinde flaş-Uncaging glutamat tarafından uyarılmış olabilir, veya komşu sinaps gelen glutamat serbest etkinleştirerek, ya elektriksel 12 veya hedeflenen optogenetic kontrol.
Taşıyıcı akım stokiyometrik bileşeninin zaman ders astrositik membran (yani glutamat boşluk) de glutamat konsantrasyonu profili ömrü ile şekillenir, glutamat taşıyıcıları, astrositlerde pasif membran özelliklerinin kinetik ve sinaptik uyarımlar, sırasında aktive sinaps 13 arasında glutamat serbest eşzamanlılık. Burada tam ayrıntılı olarak açıklar: (1) deneysel yakörnek deneysel hazırlık olarak akut fare hipokampal dilimleri kullanarak astrositlerden tam hücreli yama-kelepçe kayıtları glutamat taşıyıcı akımların stokiyometrik bileşeni izole etmek için oach, (2) analitik bir yaklaşım bu kayıtları 13, gelen glutamat açıklık zaman ders türetmek için 14. Bu yöntemler, kayıt ve merkezi sinir sistemine ait herhangi bir bölgede astrositlerden glutamat taşıyıcı akımları analiz etmek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada astrositlerden elektrofizyolojik elde etmek için deneysel bir yaklaşım tanımlamak, astrositlerde glutamat taşıyıcı akımlar izole etmek için analitik bir protokol ve bir matematiksel yöntem astrositik taşıyıcı akımlardan glutamat açıklık zaman ders elde.
Analizin başarısı astrositlerden yüksek kaliteli yama kelepçe kayıtları elde etmek için yeteneği ve taşıyıcı akımları tanımlamak için kullanılan uydurma algoritmaları doğruluğunu dayanır. Deconv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Nörolojik Bozukluklar ve İnme İntramural Araştırma Programı (NS002986) Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. AS el yazması yazdı ve deconvolution analizi uygulanmıştır. JSD deconvolution analizi ilk versiyonunu geliştirdi ve metin yorumladı.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| CGP52432 | Tocris | 1246 | |
| (R,S)-CPP | Tocris | 173 | |
| DPCPX | Tocris | 439 | |
| LY341495 disodium salt | Tocris | 4062 | |
| MSOP | Tocris | 803 | |
| NBQX disodium salt | Tocris | 1044 | |
| D,L-TBOA | Tocis | 1223 | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| MNI-L-glutamate | Tocris | 1490 | |
| Alexa 594 | Life Technologies | A10438 | Optional |
| Matrix electrodes | Frederick Haer Company | MX21AES(JD3) | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | PG10165-4 | |
| Dual-stage glass micro-pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Loctite 404 instant adhesive | Ted Pella | 46551 | |
| Xe lamp | Rapp OptoElectronic | FlashMic | |
| Igor Pro 6 | Wavemetrics |
References
- Ventura, R., Harris, K. M. Three-dimensional relationships between hippocampal synapses and astrocytes. J. Neurosci. 19, 6897-6906 (1999).
- Witcher, M. R., Kirov, S. A., Harris, K. M. Plasticity of perisynaptic astroglia during synaptogenesis in the mature rat hippocampus. Glia. 55, 13-23 (2007).
- Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
- Herman, M. A., Jahr, C. E. Extracellular glutamate concentration in hippocampal slice. J. Neurosci. 27, 9736-9741 (2007).
- Arnth-Jensen, N., Jabaudon, D., Scanziani, M. Cooperation between independent hippocampal synapses is controlled by glutamate uptake. Nat. Neurosci. 5, 325-331 (2002).
- Barbour, B. An evaluation of synapse independence. J. Neurosci. 21, 7969-7984 (2001).
- Rusakov, D. A., Kullmann, D. M. Extrasynaptic glutamate diffusion in the hippocampus: ultrastructural constraints, uptake, and receptor activation. J. Neurosci. 18, 3158-3170 (1998).
- Zerangue, N., Kavanaugh, M. P. Flux coupling in a neuronal glutamate transporter. Nature. 383, 634-637 (1038).
- Eliasof, S., Jahr, C. E. Retinal glial cell glutamate transporter is coupled to an anionic conductance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 4153-4158 (1996).
- Wadiche, J. I., Amara, S. G., Kavanaugh, M. P. Ion fluxes associated with excitatory amino acid transport. Neuron. 15, 721-728 (1995).
- Wadiche, J. I., Kavanaugh, M. P. Macroscopic and microscopic properties of a cloned glutamate transporter/chloride channel. J. Neurosci. 18, 7650-7661 (1998).
- Bergles, D. E., Jahr, C. E. Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes. Neuron. 19, 1297-1308 (1997).
- Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J. Neurosci. 25, 2906-2916 (2005).
- Scimemi, A., Tian, H. Neuronal transporters regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus. J. Neurosci. 29, 14581-14595 (2009).
- Zuo, Z. Isoflurane enhances glutamate uptake via glutamate transporters in rat glial cells. Neuroreport. 12, 1077-1080 (2001).
- Barbour, B., Brew, H., Attwell, D. Electrogenic uptake of glutamate and aspartate into glial cells isolated from the salamander (Ambystoma) retina. J. Physiol. 436, 169-193 (1991).
- Bergles, D. E., Tzingounis, A. V., Jahr, C. E. Comparison of coupled and uncoupled currents during glutamate uptake by GLT-1 transporters. J. Neurosci. 22, 10153-10162 (2002).
- Diamond, J. S., Jahr, C. E. Synaptically released glutamate does not overwhelm transporters on hippocampal astrocytes during high-frequency stimulation. J. Neurophysiol. 83, 2835-2843 (2000).
- Benediktsson, A. M., et al. Neuronal activity regulates glutamate transporter dynamics in developing astrocytes. Glia. 60, 175-188 (2012).
- Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4411-4416 (2008).
- Scimemi, A., Meabon, J., Woltjer, R. L., Sullivan, J. M., Diamond, J. S., Cook, D. G. Amyloidβ1-42 slows clearance of synaptically-released glutamate by mislocalizing astrocytic GLT-1. J. Neurosci. 33, 5312-5318 (2013).
