مقايسة الهجرة الخلية الكمي لالفئران العصبية المعوية أسلاف
Summary
نقدم بحكم فيفو خلية مقايسة الهجرة التي تسمح الكمي الدقيق للالمعوي العصبية المحتملة الهجرة الخلية قمة في وجود عوامل النمو المختلفة.
Abstract
الخلايا العصبية قمة (NCC) هي خلية السكان عابرة ومتعددة القدرات التي تنبع من الأنبوب العصبي الظهري ويهاجر على نطاق واسع في جميع أنحاء الفقاريات النامية الجنين. بالإضافة إلى توفير الدبقية والخلايا العصبية الطرفية، NCC توليد الخلايا الصباغية وكذلك معظم هيكل عظمي القحف الوجهي. يتم التحكم NCC الهجرة والتمايز من خلال مزيج من الأصل المحوري على طول الأنبوب العصبي وتعرضهم للالعظة خارج الخلية متميزة إقليميا. هذه المساهمة من خارج الخلية بروابط هو واضح خصوصا خلال تشكيل النظام العصبي المعوي (ENS)، وهي شبكة معقدة مترابطة من العقد العصبية التي تتحكم محليا (بين أمور أخرى) حركة العضلات والأمعاء على الحركة المعوية. ويستمد معظم ENS من مجموعة صغيرة من الأولي NCC أن القيام برحلة طويلة من أجل استعمار – في منقاري إلى الذيلية الأزياء – على طول القناة الهضمية المحتملين. من بين عدة مسارات الإشارات المعروفة لالتأثير المعوي NCC الاستعمار، ومن المسلم به GDNF / RET إشارات على أنها الأكثر أهمية. في الواقع، تسيطر إفراز spatiotemporally من RET يجند GDNF من اللحمة المتوسطة الأمعاء هو المسؤول الرئيسي لجذب وتوجيه، معربا عن RET المعوي NCC إلى وداخل القناة الهضمية الجنينية. هنا، نحن تصف فيفو السابقين فحص الهجرة الخلية، والاستفادة من خط الماوس المعدلة وراثيا امتلاك fluorescently المسمى NCC، والذي يسمح الكمي الدقيق للالمعوية المحتملة الهجرة NCC في وجود عوامل النمو المختلفة، بما في ذلك GDNF.
Introduction
الخلايا العصبية قمة (NCC) هي نوع من الخلايا عابرة فريدة لالفقاريات التي تشكل العديد من المشتقات أثناء تطور الجنين. تنشأ هذه الفئة من السكان الخلية على الحدود من لوحة العصبية، المتاخمة للالأديم الظاهر غير العصبية 1. أثناء تكون العصيبة، الانحناء من الأماكن لوحة العصبية NCC على طول الحافة الظهرية من تشكيل الأنبوب العصبي. NCC ثم الخضوع لالظهارية الانتقالية الوسيطة، وفصل المهاجرة بعيدا عن الأنبوب العصبي. NCC استعمار مختلف الهياكل الجنينية، بما في ذلك الجهاز الهضمي حيث أنها تشكل الجهاز العصبي المعوي بأكمله (ENS)، وهي شبكة مترابطة من العقد العصبية جزءا لا يتجزأ في جدار الأمعاء. كما استعرضت مؤخرا 2،3، وقد شاركت العديد من الجينات في تطوير هذه البنية المعقدة.
ويستمد معظم ENS من مجموعة صغيرة من NCC تنشأ من الأنبوب العصبي المبهم (أي حول الحدود المستقبلية الدماغ المؤخر / الحبل الشوكي) 4.هذه الأسلاف العصبية تصل إلى المعى الأمامي حول يوم الجنينية (ه) 9.0 في الفئران ثم تهاجر نحو caudally داخل اللحمة المتوسطة الأمعاء حتى e15.0 تقريبا لاستعمار الامعاء الجنينية كله. يتم توفير مجموعة فرعية صغيرة من الأسلاف العصبية القولون أيضا العجزية NCC، التي تغزو الأمعاء الخلفي في الاتجاه المعاكس حتى الأعور 4. كلا المبهم والعجزية NCC تتطلب متعددة الهجرة، الانتشار، والبقاء على قيد الحياة تعزيز التمايز العظة لضمان تشكيل كامل للENS. في هذا الصدد، النماذج الحيوانية – وخاصة الفئران المعدلة وراثيا – كان لها دور أساسي في تحديد عدة بروابط خارج الخلية الأساسية: GDNF (الدبقية المستمدة من الخلايا عامل التغذية العصبية)، Endothelin-3، Neurotrophin-3، أفضل الممارسات الإدارية (العظام البروتينات morphogenic)، Netrin ، وكذلك سونيك القنفذ الهندي و(شش وIHH) 5-10. من هذه، GDNF من خلال إشارات التيروزين كيناز عبر الغشاء مستقبلات RET (مؤجلة خلال ترنسفكأيشن) يتم التعرف على اله الطريق الأكثر أهمية لجذب وتوجيه NCC إلى وداخل القناة الهضمية الجنينية. ويفرز GDNF من اللحمة المتوسطة الأمعاء ويشكل التدرج rosrrocaudal تسيطر spatiotemporally هذا هو chemoattractive مباشرة إلى المعوية NCC والتي تعبر RET 11،12.
بين وظائف أخرى، وENS ينظم الحركة داخل الجهاز الهضمي من خلال تفاعله مع العضلات الملساء في جدار الأمعاء. غياب العقد العصبية في المنطقة الطرفية من نتائج الأمعاء في مرض هيرشسبرونغ: انكماش منشط للجزء المتأثر يؤدي إلى انسداد، وتراكم المنبع من المواد هضمها وانتفاخ هائلة من الأمعاء والبطن. يحدث المرض هيرشسبرونغ ما يقرب من واحد في 5،000 ولادة حية. ويعتقد أن نمط الهجرة rostro الذيلية المعوي NCC أن يكون عاملا مساهما الرئيسي لمسببات المرض هيرشسبرونغ. القولون، أبعد من مصدر المهاجرة NCC والجزء الأخير من بowel أن المستعمر، هو الأكثر عرضة للعيوب في تشكيل ENS. وفقا لدورها الحاسم في المعوي الهجرة NCC، تعطل GDNF / RET الإشارات هو سبب وراثي معروف الرئيسي للمرض هيرشسبرونغ 13.
لدراسة أفضل NCC والتنمية ENS، ولدت لدينا خط الماوس المعدلة وراثيا – اسمه Gata4p [5KB]-GFP 14 – التي وصفت المهاجرة NCC مع بروتين الفلورية الخضراء (GFP). نحن الكمال المقبل بحكم فيفو مقايسة الهجرة الخلية، مقتبسة من الأعمال المنشورة من قبل مجموعات أخرى 11،12،15، التي تسمح الآن الكمي الدقيق للالمعوية المحتملة الهجرة NCC في وجود عوامل النمو المختلفة، مثل GDNF.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتبين لنا كيف يمكن استخدام لدينا فيفو السابقين الثقافة ازدراع تقنية لقياس بدقة المعوية المحتملة الهجرة NCC في وجود GDNF. ومثل هذا القياس الكمي الدقيق سهلت إلى حد كبير باستخدام 200 ميكرون سميكة المقاطع vibratome الأمعاء بدلا من قطع كبيرة من حجم تقريبي، كما هو موضح سابقا <su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر دينيس Flipo لمعالجة الصور وتحليلها وتقديم المشورة، وديفيد دبليو السيلفر في المختبر الذي تم إنشاء خط الماوس Gata4p [5KB]-GFP. ويتم تمويل البحوث في المختبر بيلون من قبل CIHR، NSERC، FRQS وFRQNT.
Materials
| DMEM powder | Wisent | 219-010-XK | |
| NaHCO3 | Bioshop | SOB999 | Biotechnology grade |
| Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron) | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Penicilin-Streptomycin solution, 100x | Wisent | 450-201-EL | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 095-150 | High quality grade |
| Collagen I | BD biosciences | 354236 | |
| NaOH | Bioshop | SHY700 | Diluted from 10 N stock then sterile-filtered |
| GDNF | Cedarlane | CLCYT305 | |
| Falcon 24-well Plate | BD biosciences | 353047 | |
| Dissecting scissors | Fisher Scientific | 089515 | |
| Glass Petri dish | VWR | 89000-306 | |
| PBS | Sigma | P5493 | Cell culture grade |
| Dissecting microscope | Leica | M125 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001 | Biotechnology grade |
| Surgical blade | Feather | 21 | |
| All Purpose Instant Krazy Glue Pen | Krazy Glue | KG824 | |
| HM 650V Vibrating-Blade Microtome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 |
References
- Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).
- Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. The developmental genetics of Hirschsprung’s disease. Clin. Genet. 83 (1), 15-22 (2013).
- Obermayr, F., Hotta, R., Enomoto, H., Young, H. M. Development and developmental disorders of the enteric nervous system. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 10 (1), 43-57 (2012).
- Sasselli, V., Pachnis, V., Bursn, A. J. The enteric nervous system. Dev. Biol. 366 (1), 64-73 (2012).
- Sanchez, M. P., Silos-Santiago, I., et al. Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF. Nature. 382 (6586), 70-73 (1996).
- Baynash, A. G., Hosoda, K., et al. Interaction of endothelin-3 with endothelin-B receptor is essential for development of epidermal melanocytes and enteric neurons. Cell. 79 (7), 1277-1285 (1994).
- Chalazonitis, A., Pham, T. D., et al. Neurotrophin-3 is required for the survival-differentiation of subsets of developing enteric neurons. J. Neurosci. 21 (15), 5620-5636 (2001).
- Goldstein, A. M., Brewer, K. C., Doyle, A. M., Nagy, N., Roberts, D. J. BMP signaling is necessary for neural crest cell migration and ganglion formation in the enteric nervous system. Mech. Dev. 122 (6), 821-833 (2005).
- Jiang, Y., Liu, M. T., Gershon, M. D. Netrins and DCC in the guidance of migrating neural crest-derived cells in the developing bowel and pancreas. Dev. Biol. 258 (2), 364-384 (2003).
- Ramalho-Santos, M., Melton, D. A., McMahon, A. P. Hedgehog signals regulate multiple aspects of gastrointestinal development. Development. 127 (12), 2763-2772 (2000).
- Natarajan, D., Marcos-Gutierrez, C., Pachnis, V., de Graaf, E. Requirement of signaling by receptor tyrosine kinase RET for the directed migration of enteric nervous system progenitor cells during mammalian embryogenesis. Development. 129 (22), 5151-5160 (2002).
- Young, H. M., Hearn, C. J., et al. GDNF Is a chemoattractant for enteric neural cells. Dev. Biol. 229 (2), 503-516 (2001).
- Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J. Med. Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
- Pilon, N., Raiwet, D., Viger, R. S., Silversides, D. W. Novel pre- and post-gastrulation expression of Gata4 within cells of the inner cell mass and migratory neural crest cells. Dev. Dyn. 237 (4), 1133-1143 (2008).
- Nagy, N., Goldstein, A. M. Endothelin-3 regulates neural crest cell proliferation and differentiation in the hindgut enteric nervous system. Dev. Biol. 293 (1), 203-217 (2006).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersen, K., Behringer, R. . Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , 209-250 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Byth, K. F., Thomas, A., et al. AZD5438, a potent oral inhibitor of cyclin-dependent kinases 1, 2, and 9, leads to pharmacodynamic changes and potent antitumor effects in human tumor xenografts. Mol. Cancer Ther. 8 (7), 1856-1866 (2009).
