Summary

Un saggio di migrazione cellulare quantitativa per murini enterici neurali Progenitori

Published: September 18, 2013
doi:

Summary

Presentiamo un ex vivo delle cellule saggio di migrazione che permette una precisa quantificazione della enterico potenziale migrazione delle cellule della cresta neurale in presenza di vari fattori di crescita.

Abstract

Cellule della cresta neurale (NCC) sono una popolazione transitoria e multipotenti cellule che proviene dal tubo neurale dorsale e migra ampiamente in tutto il vertebrato sviluppo dell'embrione. Oltre a fornire glia e neuroni periferici, NCC generare melanociti nonché la maggior parte dello scheletro cranio-facciale. Migrazione NCC e la differenziazione è controllata da una combinazione della loro origine assiale lungo il tubo neurale e la loro esposizione ai segnali extracellulari regionale distinti. Tale contributo di ligandi extracellulari è particolarmente evidente durante la formazione del sistema nervoso enterico (ENS), una complessa rete interconnessa di gangli neurale che controlla localmente (tra le altre cose) movimento intestinale muscolare e la motilità intestinale. La maggior parte della ENS è derivato da una piccola piscina iniziale di NCC che intraprendere un lungo viaggio per colonizzare – in un rostrale alla moda caudale – l'intera lunghezza del futuro dell'intestino. Tra le varie vie di segnalazione noti perinfluenza enterico colonizzazione NCC, GDNF segnalazione / RET è riconosciuto come il più importante. Infatti, la secrezione controllata spatiotemporally della RET ligando GDNF dal mesenchima intestino è principalmente responsabile per l'attrazione e la guida di-RET esprimere enterico NCC da e all'interno dell'intestino embrionale. Qui, descriviamo un ex vivo saggio migrazione cellulare, facendo uso di una linea di topi transgenici in possesso fluorescente NCC, che permette una precisa quantificazione della enterico potenziale migrazione NCC in presenza di vari fattori di crescita, tra GDNF.

Introduction

Cellule della cresta neurale (NCC) sono un tipo di cellula transitoria unica di vertebrati che si forma molti derivati ​​durante lo sviluppo embrionale. Questa popolazione di cellule si pone al confine della placca neurale, adiacente al ectoderma non-neurale 1. Durante neurulazione, piegatura dei luoghi placca neurale NCC lungo il bordo dorsale del tubo neurale formatura. NCC poi subire una transizione epitelio-mesenchimale, segregazione e la migrazione dal tubo neurale. NCC colonizzare varie strutture embrionali compresi il tratto digestivo dove formano l'intero sistema nervoso enterico (ENS), una rete interconnessa di gangli nervosi incorporato nella parete intestinale. Come recentemente rivisto 2,3, molti geni sono stati coinvolti nello sviluppo di questa intricata struttura.

La maggior parte della ENS è derivato da una piccola piscina di NCC provenienti dal tubo neurale vagale (ossia circa il limite prospettico hindbrain / midollo spinale) 4.Questi progenitori neurali raggiungono il foregut intorno al giorno embrionale (e) 9.0 nei topi e poi migrano caudale all'interno del mesenchima intestino fino a circa e15.0 a colonizzare l'intero intestino embrionali. Un sottoinsieme minore di progenitori neurali colon è fornito anche da sacrale NCC, che invadono l'intestino posteriore in direzione opposta fino al cieco 4. Sia vagale e sacrale NCC richiedere più migrazione, proliferazione, sopravvivenza e spunti-differenziazione promuovere per garantire la formazione completa della ENS. A questo proposito, i modelli animali – topi geneticamente modificati, in particolare – sono state fondamentali per l'identificazione dei vari ligandi extracellulari essenziali: GDNF (glial cellule fattore neurotrofico derivato), dell'endotelina-3, neurotrofina-3, (proteine ​​morfogenetiche dell'osso) BMP, Netrin , così come Sonic e indiano Hedgehog (Shh e Ihh) 5-10. Di questi, GDNF segnalazione attraverso il RET recettore transmembrana tirosin chinasi (Risistemato durante la transfezione), è riconosciuto come esimoe percorso più critico per l'attrazione e la guida di NCC da e all'interno dell'intestino embrionale. GDNF è secreto dal mesenchima intestino e forma un gradiente rosrrocaudal controllato spatiotemporally che è direttamente chemoattractive a enterico NCC, che esprimono RET 11,12.

Fra le altre funzioni, l'ENS regola il movimento all'interno del tubo digerente attraverso la sua interazione con la muscolatura liscia della parete intestinale. Assenza di gangli nervosi nella regione terminale dei risultati intestinali nella malattia di Hirschsprung: contrazione tonica del segmento interessato conduce al blocco, l'accumulo a monte del materiale digerito e massiccia distensione dell'intestino e dell'addome. La malattia di Hirschsprung si verifica circa uno su 5.000 nati vivi. Il modello migratorio rostro-caudale enterico NCC si crede di essere il principale fattore che contribuisce alla eziologia della malattia di Hirschsprung. Il colon, più lontana dalla fonte di migrazione NCC e ultima porzione di bowel ad essere colonizzato, è più suscettibile a difetti nella formazione ENS. In conformità con il suo ruolo cruciale nella migrazione enterico NCC, interruzione del segnale GDNF / RET è la principale causa conosciuta genetica della malattia di Hirschsprung 13.

Per studiare meglio NCC e sviluppo ENS, abbiamo generato una linea di topi transgenici – chiamato Gata4p [5kb]-GFP 14 – in cui migratori NCC sono etichettati con la Green Fluorescent Protein (GFP). Abbiamo poi messo a punto un saggio ex vivo migrazione cellulare, adattato dal lavoro pubblicato da altri gruppi 11,12,15, che ora consente una precisa quantificazione della enterico potenziale migrazione NCC in presenza di vari fattori di crescita, quali GDNF.

Protocol

Dichiarazione etica Gli esperimenti che coinvolgono i topi sono stati eseguiti a seguito Canadian Consiglio di linee guida per la cura degli animali per la cura e la manipolazione di animali utilizzati nella ricerca medica. Protocolli che comportano la manipolazione di animali sono stati approvati dal comitato etico istituzionale dell'Università del Quebec a Montreal (Comité de Protection des institutionnel Animaux, il numero di riferimento 0512-R3-650-0513). 1….

Representative Results

I seguenti risultati sono rappresentativi di quello ottenibile con la tecnica descritta qui (Figura 1). L'impiego di fattori di crescita (cioè GDNF) stimola la migrazione di GFP che esprimono enterico NCC dal espianto intestinale e nel gel di collagene (Figura 2). Sebbene alcune cellule escono espianto in assenza di fattori di crescita, questi non sono per lo GFP-etichettata e rappresentano entrata passiva. È necessario rimuovere la fetta intestinale dal gel di collagene …

Discussion

Mostriamo come il nostro ex vivo espianto cultura tecnica può essere utilizzata per quantificare con precisione enterico migrazione potenziale NCC in presenza di GDNF. Tale quantificazione precisa è notevolmente semplificata ricorrendo a 200 micron di spessore sezioni vibratome budello invece di grandi pezzi di dimensioni approssimative, come descritto in precedenza 11,12,15. In effetti, questo ci permette di lavorare con un numero ragionevole di cellule in un ambiente altamente riproducibile. Da n…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Denis Flipo per consigli elaborazione delle immagini e analisi, e David W. Silversides nel cui laboratorio è stata generata la linea di topi Gata4p [5kb]-GFP. La ricerca in laboratorio Pilon è finanziato dal CIHR, NSERC, FRQS e FRQNT.

Materials

DMEM powder Wisent 219-010-XK
NaHCO3 Bioshop SOB999 Biotechnology grade
Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron) EMD Millipore SCGP00525
Penicilin-Streptomycin solution, 100x Wisent 450-201-EL
Fetal bovine serum Wisent 095-150 High quality grade
Collagen I BD biosciences 354236
NaOH Bioshop SHY700 Diluted from 10 N stock then sterile-filtered
GDNF Cedarlane CLCYT305
Falcon 24-well Plate BD biosciences 353047
Dissecting scissors Fisher Scientific 089515
Glass Petri dish VWR 89000-306
PBS Sigma P5493 Cell culture grade
Dissecting microscope Leica M125
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-20
Agarose Bioshop AGA001 Biotechnology grade
Surgical blade Feather 21
All Purpose Instant Krazy Glue Pen Krazy Glue KG824
HM 650V Vibrating-Blade Microtome Thermo Scientific 920110
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
DAPI Sigma-Aldrich D9564

References

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Cite This Article
Bergeron, K., Cardinal, T., Pilon, N. A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors. J. Vis. Exp. (79), e50709, doi:10.3791/50709 (2013).

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