En kvantitativ Cell Migration Assay for Murine Enteriske Neural Progenitorer
Summary
Vi præsenterer en ex vivo celle migration assay, der tillader præcis kvantificering af entero neurale potentiale våbenskjold celle migration i tilstedeværelsen af forskellige vækstfaktorer.
Abstract
Neuralkam celler (NCC) er en forbigående og multipotent celle befolkning, der stammer fra den dorsale neuralrøret og migrerer udførligt i hele udviklingen af hvirveldyr embryo. Ud over at give perifere glia og neuroner, NCC generere melanocytter samt det meste af skelettet kranio-ansigtsbehandling. NCC migration og differentiering styres af en kombination af deres aksiale oprindelse langs neuralrøret og deres eksponering for regionalt forskellige ekstracellulære signaler. Sådanne bidrag af ekstracellulære ligander er især tydeligt under dannelsen af det enteriske nervesystem (ENS), et kompleks indbyrdes forbundet netværk af neurale ganglier at lokalt styrer (blandt andet) gut muskelbevægelser og tarm motilitet. De fleste af ENS er afledt af en lille indledende pulje af NCC at foretage en lang rejse for at kolonisere – i en rostralt caudal fashion – hele længden af den potentielle tarmen. Blandt flere signalveje, der vides atpåvirke enteriske NCC kolonisering, er GDNF / RET signalering anerkendt som den vigtigste. Faktisk spatiotemporally styret sekretion af RET ligand GDNF af tarmen mesenkymet er hovedansvarlig for tiltrækning og vejledning af RET-udtrykker enteriske NCC til og inden for embryonale tarmen. Her beskriver vi en ex vivo-celle migration assay, der gør brug af en transgen mus linje besidder fluorescensmærket NCC, som muliggør en præcis kvantificering af enterisk NCC migration potentiale i nærvær af forskellige vækstfaktorer, herunder GDNF.
Introduction
Neuralkam celler (NCC) er en forbigående celletype unikke for hvirveldyr, der danner mange derivater under fosterudviklingen. Denne celle population opstår på grænsen til den neurale plade, der støder op til ikke-neurale ectoderm 1. Under neurulation, bøjning af de neurale plade steder NCC langs ryggens kant danner neuralrøret. NCC derefter gennemgå en epitelial-mesenkymal overgang, adskillelse og migrere væk fra neuralrøret. NCC kolonisere forskellige embryoniske strukturer, herunder fordøjelseskanalen, hvor de danner hele enteriske nervesystem (ENS), et sammenhængende netværk af neurale ganglier indlejret i tarmvæggen. Som det for nylig revideret 2,3, har mange gener er involveret i udviklingen af denne indviklede struktur.
De fleste af ENS er afledt fra en lille pulje af NCC oprindelse fra vagus neuralrøret (dvs. omkring den potentielle baghjerne / rygmarv afgrænsning) 4.Disse neurale progenitorer nå foregut omkring embryonisk dag (e) 9.0 i mus og derefter migrere kaudalt i tarmen mesenkymet til ca e15.0 at kolonisere hele embryonale tarmene. En mindre delmængde af colon neurale stamfædre er også leveret af sakral NCC, der invadere den bageste tarmen i den modsatte retning op til coecum 4.. Både vagal og sakrale NCC kræver flere migration-, proliferation-, overlevelse-og differentiering-fremmende signaler for at sikre fuldstændig dannelse af ENS. I denne henseende dyremodeller – især genetisk modificerede mus – har været medvirkende til at identificere flere væsentlige ekstracellulære ligander: GDNF (gliacelle neurotrofisk faktor), Endothelinreceptor-3, neurotrofin-3, BMP (knoglemorfogene proteiner), Netrin , såvel som Sonic og indiske Pindsvin (Shh og Ihh) 5-10. Af disse er GDNF signalering gennem tyrosinkinase transmembranreceptor RET (rearrangerede under transfektion) anerkendes som the mest kritiske vej for tiltrækning og vejledning af NCC til og inden for embryonale tarmen. GDNF udskilles af tarmen mesenkymet og danner en spatiotemporally kontrolleret rosrrocaudal forløb, der er direkte chemoattractive til enteriske NCC, som udtrykker RET 11,12.
Blandt andre funktioner, ENS regulerer bevægelsen i fordøjelseskanalen gennem dens samspil med den glatte muskulatur i tarmvæggen. Fravær af neurale ganglier i terminale region af tarmen resulterer i Hirschsprungs sygdom: tonic sammentrækning af det pågældende segment fører til blokering opstrøms akkumulering af nedbrudt materiale og massiv udspilning af tarmen og maven. Hirschsprungs sygdom opstår cirka en ud af 5.000 levendefødte. Den Rostro-caudale migration mønster af enteriske NCC menes at være den vigtigste faktor i ætiologien af Hirschsprungs sygdom. Tyktarmen længst væk fra kilden til at migrere NCC og sidste portion bOwel at blive koloniseret, er mest modtagelige for defekter i ENS formation. I overensstemmelse med sin afgørende rolle i enterisk NCC migration, afbrydelse af GDNF / RET signalering er den vigtigste kendte genetiske årsag til Hirschsprungs sygdom 13..
For bedre at studere NCC og ENS udvikling, vi genererede en transgen mus linje – opkaldt Gata4p [5 kb]-GFP 14 – hvor vandrende NCC er mærket med grønt fluorescerende protein (GFP). Vi næste perfektioneret en ex vivo celle migration assay, tilpasset fra offentliggjorte arbejde med andre grupper 11,12,15, der nu tillader præcis kvantificering af entero NCC migration potentiale i tilstedeværelsen af forskellige vækstfaktorer, såsom GDNF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi viser, hvordan vores ex vivo eksplantation kultur teknik kan bruges til præcist at kvantificere enterisk NCC migration potentiale i nærværelse af GDNF. En sådan præcis kvantificering er blevet betydeligt nemmere ved hjælp af 200 um tykke vibratome gut sektioner i stedet for store stykker af omtrentlige størrelse, som tidligere beskrevet 11,12,15. Faktisk er det muligt for os at arbejde med et rimeligt antal af celler i en meget reproducerbar indstilling. Det skal bemærkes, at en ensartet f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Denis Flipo til billedbehandling og analyse rådgivning, og David W. Silversides i hvis laboratorium Gata4p [5 kb]-GFP mus linje blev genereret. Forskning i Pilon laboratorium er finansieret af CIHR, NSERC, FRQS og FRQNT.
Materials
| DMEM powder | Wisent | 219-010-XK | |
| NaHCO3 | Bioshop | SOB999 | Biotechnology grade |
| Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron) | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Penicilin-Streptomycin solution, 100x | Wisent | 450-201-EL | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 095-150 | High quality grade |
| Collagen I | BD biosciences | 354236 | |
| NaOH | Bioshop | SHY700 | Diluted from 10 N stock then sterile-filtered |
| GDNF | Cedarlane | CLCYT305 | |
| Falcon 24-well Plate | BD biosciences | 353047 | |
| Dissecting scissors | Fisher Scientific | 089515 | |
| Glass Petri dish | VWR | 89000-306 | |
| PBS | Sigma | P5493 | Cell culture grade |
| Dissecting microscope | Leica | M125 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001 | Biotechnology grade |
| Surgical blade | Feather | 21 | |
| All Purpose Instant Krazy Glue Pen | Krazy Glue | KG824 | |
| HM 650V Vibrating-Blade Microtome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 |
References
- Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).
- Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. The developmental genetics of Hirschsprung’s disease. Clin. Genet. 83 (1), 15-22 (2013).
- Obermayr, F., Hotta, R., Enomoto, H., Young, H. M. Development and developmental disorders of the enteric nervous system. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 10 (1), 43-57 (2012).
- Sasselli, V., Pachnis, V., Bursn, A. J. The enteric nervous system. Dev. Biol. 366 (1), 64-73 (2012).
- Sanchez, M. P., Silos-Santiago, I., et al. Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF. Nature. 382 (6586), 70-73 (1996).
- Baynash, A. G., Hosoda, K., et al. Interaction of endothelin-3 with endothelin-B receptor is essential for development of epidermal melanocytes and enteric neurons. Cell. 79 (7), 1277-1285 (1994).
- Chalazonitis, A., Pham, T. D., et al. Neurotrophin-3 is required for the survival-differentiation of subsets of developing enteric neurons. J. Neurosci. 21 (15), 5620-5636 (2001).
- Goldstein, A. M., Brewer, K. C., Doyle, A. M., Nagy, N., Roberts, D. J. BMP signaling is necessary for neural crest cell migration and ganglion formation in the enteric nervous system. Mech. Dev. 122 (6), 821-833 (2005).
- Jiang, Y., Liu, M. T., Gershon, M. D. Netrins and DCC in the guidance of migrating neural crest-derived cells in the developing bowel and pancreas. Dev. Biol. 258 (2), 364-384 (2003).
- Ramalho-Santos, M., Melton, D. A., McMahon, A. P. Hedgehog signals regulate multiple aspects of gastrointestinal development. Development. 127 (12), 2763-2772 (2000).
- Natarajan, D., Marcos-Gutierrez, C., Pachnis, V., de Graaf, E. Requirement of signaling by receptor tyrosine kinase RET for the directed migration of enteric nervous system progenitor cells during mammalian embryogenesis. Development. 129 (22), 5151-5160 (2002).
- Young, H. M., Hearn, C. J., et al. GDNF Is a chemoattractant for enteric neural cells. Dev. Biol. 229 (2), 503-516 (2001).
- Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J. Med. Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
- Pilon, N., Raiwet, D., Viger, R. S., Silversides, D. W. Novel pre- and post-gastrulation expression of Gata4 within cells of the inner cell mass and migratory neural crest cells. Dev. Dyn. 237 (4), 1133-1143 (2008).
- Nagy, N., Goldstein, A. M. Endothelin-3 regulates neural crest cell proliferation and differentiation in the hindgut enteric nervous system. Dev. Biol. 293 (1), 203-217 (2006).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersen, K., Behringer, R. . Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , 209-250 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Byth, K. F., Thomas, A., et al. AZD5438, a potent oral inhibitor of cyclin-dependent kinases 1, 2, and 9, leads to pharmacodynamic changes and potent antitumor effects in human tumor xenografts. Mol. Cancer Ther. 8 (7), 1856-1866 (2009).
