Un test migration cellulaire quantitative pour murins de neurones entériques progéniteurs
Summary
Nous présentons une analyse ex vivo de la migration cellulaire qui permet une quantification précise du potentiel de la migration des cellules de la crête neurale entérique en présence de divers facteurs de croissance.
Abstract
Cellules de la crête neurale (CCN) sont une population de cellules multipotentes transitoire et qui provient du tube neural dorsal et migre intensivement dans l'ensemble du développement de l'embryon des vertébrés. En plus de fournir des cellules gliales et neurones périphériques, CCN générer mélanocytes ainsi que la plupart du squelette cranio-facial. La migration et la différenciation CCN est contrôlé par une combinaison de leur origine axiale le long du tube neural et leur exposition aux signaux extracellulaires distinctes suivant les régions. Un tel apport de ligands extracellulaires est particulièrement évident au cours de la formation du système nerveux entérique (ENS), un réseau complexe interconnecté de ganglions nerveux qui commande localement (entre autres) un mouvement intestin musculaire et la motilité intestinale. La plupart de l'ENS est dérivé d'un petit groupe initial de la CCN qui entreprennent un long voyage afin de coloniser – dans un rostre à la mode caudale – toute la longueur de l'intestin prospective. Parmi plusieurs voies de signalisation connues de l'influencer entérique colonisation CCN, le GDNF / signalisation de RET est reconnu comme le plus important. En effet, la sécrétion spatio-temporelle contrôlée du ligand GDNF RET par le mésenchyme de l'intestin est le principal responsable de l'attraction et de l'orientation de RET exprimant entérique CCN et dans l'intestin embryonnaire. Ici, nous décrivons une analyse ex vivo de la migration des cellules, ce qui rend l'utilisation d'une lignée de souris transgéniques possédant CCN marqué par fluorescence, ce qui permet une quantification précise du potentiel de migration CCN entérique en présence de divers facteurs de croissance, y compris le GDNF.
Introduction
Cellules de la crête neurale (CCN) sont un type de cellule transitoire unique de vertébrés qui forme de nombreux dérivés au cours du développement de l'embryon. Cette population de cellules se présente à la frontière de la plaque neurale, à côté de l'ectoderme neural non-1. Au cours de la neurulation, flexion des plaques lieux neuronaux de la CCN le long de la partie dorsale du tube neural se former. CCN subit alors une transition épithéliale-mésenchymateuse, la ségrégation et la migration à partir du tube neural. CCN coloniser différentes structures embryonnaires, y compris le tube digestif où ils forment l'ensemble du système nerveux entérique (SNE), un réseau interconnecté de ganglions nerveux intégré dans la paroi intestinale. Comme l'a récemment examiné 2,3, de nombreux gènes ont été impliqués dans le développement de cette structure complexe.
La plupart de l'ENS est dérivé d'un petit pool de NCC provenant du tube neural vagal (soit de l'ordre de la limite rhombencéphale / moelle épinière prospective) 4.Ces progéniteurs neuronaux atteignent l'intestin antérieur autour du jour embryonnaire (e) 9.0 chez la souris, puis migrent caudalement dans le mésenchyme de l'intestin jusqu'à environ e15.0 de coloniser l'ensemble des intestins embryonnaires. Un sous-groupe mineur de cellules progénitrices neurales du côlon est également fourni par sacral CCN, qui envahissent l'intestin postérieur dans la direction opposée jusqu'à la caecum 4. Les deux vagal et sacrée CCN exige multiples migration, la prolifération, la survie et de signaux de différenciation promotion pour assurer la formation complète de l'ENS. À cet égard, les modèles animaux – souris en particulier génétiquement modifiés – ont joué un rôle dans l'identification de plusieurs ligands extracellulaires essentielles: GDNF (glial facteur neurotrophique dérivé des cellules), l'endothéline-3, la neurotrophine-3, (protéines morphogénétiques osseuses) MPG, Netrin , ainsi que Sonic et Indian Hedgehog (Shh et Ihh) 5-10. Parmi ceux-ci, la signalisation par le GDNF RET de récepteur transmembranaire de la tyrosine kinase (Rearranged pendant la transfection) est reconnu comme l'ee voie la plus critique pour l'attraction et la direction de la CCN et à l'intérieur de l'intestin embryonnaire. GDNF est sécrétée par le mesenchyme de l'intestin et forme un gradient spatio-temporellement rosrrocaudal contrôlé qui est directement chimio-attractifs pour entérique CCN, qui expriment RET 11,12.
Entre autres fonctions, l'ENS règle le mouvement dans le tube digestif par son interaction avec le muscle lisse de la paroi intestinale. Absence de ganglions nerveux dans la région terminale des résultats de l'intestin dans la maladie de Hirschsprung: contraction tonique du segment affecté conduit à un blocage, l'accumulation en amont de la matière digérée et la distension massive de l'intestin et de l'abdomen. La maladie de Hirschsprung se produit environ un sur 5000 naissances vivantes. Le motif de la migration rostro-caudale de entérique CCN est considéré comme le principal facteur contribuant à l'étiologie de la maladie de Hirschsprung. Le côlon, le plus éloigné de la source de migration NCC et dernière partie de bowel être colonisé, est le plus sensible à des défauts dans la formation ENS. Conformément à son rôle crucial dans la migration CCN entérique, la perturbation de la signalisation GDNF / RET est la principale cause génétique connue de la maladie de Hirschsprung 13.
Pour mieux étudier la CCN et le développement de l'ENS, nous avons généré une lignée de souris transgénique – nommé Gata4p [5 kb]-GFP 14 – dans laquelle migratoire CCN sont marquées avec la protéine fluorescente verte (GFP). On a ensuite mis au point un test ex vivo de la migration cellulaire, adapté de travaux publiés par d'autres groupes 11,12,15, qui permet une quantification précise maintenant le potentiel de migration CCN entérique en présence de divers facteurs de croissance, tels que le GDNF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous montrons comment notre ex vivo technique de culture des explants peut être utilisé pour quantifier précisément le potentiel de migration entérique CCN en présence de GDNF. Une telle quantification précise est grandement facilitée par l'utilisation de 200 sections vibratome intestinale um d'épaisseur à la place de grands morceaux de la taille approximative, comme décrit précédemment 11,12,15. En effet, cela nous permet de travailler avec un nombre raisonnable de cellules dans…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Denis Flipo pour obtenir des conseils de traitement et d'analyse d'images, et David W. Silversides en laboratoire dont la ligne de la souris Gata4p [5 kb]-GFP a été générée. La recherche dans le laboratoire Pilon est financé par les IRSC, le CRSNG, FRQS et FRQNT.
Materials
| DMEM powder | Wisent | 219-010-XK | |
| NaHCO3 | Bioshop | SOB999 | Biotechnology grade |
| Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron) | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Penicilin-Streptomycin solution, 100x | Wisent | 450-201-EL | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 095-150 | High quality grade |
| Collagen I | BD biosciences | 354236 | |
| NaOH | Bioshop | SHY700 | Diluted from 10 N stock then sterile-filtered |
| GDNF | Cedarlane | CLCYT305 | |
| Falcon 24-well Plate | BD biosciences | 353047 | |
| Dissecting scissors | Fisher Scientific | 089515 | |
| Glass Petri dish | VWR | 89000-306 | |
| PBS | Sigma | P5493 | Cell culture grade |
| Dissecting microscope | Leica | M125 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001 | Biotechnology grade |
| Surgical blade | Feather | 21 | |
| All Purpose Instant Krazy Glue Pen | Krazy Glue | KG824 | |
| HM 650V Vibrating-Blade Microtome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 |
References
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