Summary

Eine quantitative Assay für Zellmigration Murine Enteric neuralen Vorläuferzellen

Published: September 18, 2013
doi:

Summary

Wir stellen ein ex vivo-Assay, der die Zellmigration präzise Quantifizierung der ente Neuralleistenzellen Migrationspotential in Gegenwart von verschiedenen Wachstumsfaktoren ermöglicht.

Abstract

Neuralleistenzellen (NCC) sind eine vorübergehende und multiZellPopulation, die aus dem dorsalen Neuralrohr stammt und ausgiebig wandert in den Entwicklungswirbeltierembryo. Neben der Bereitstellung von peripheren Neuronen und Glia, NCC erzeugen Melanozyten sowie die meisten der Schädel-Gesichtsskeletts. NCC Migration und Differenzierung wird durch eine Kombination ihrer axialen Ursprung entlang des Neuralrohrs und ihrer Ausrichtung auf regional unterschiedliche extrazelluläre Signale gesteuert. Ein solcher Beitrag der extrazellulären Liganden bei der Bildung des enterischen Nervensystem (ENS), einem komplexen Netzwerk von miteinander verbundenen neuralen Ganglien, die lokal steuert (unter anderem) Darmmuskelbewegung und Darmmotilität besonders deutlich. In einem rostral Schwanz fashion – – über die gesamte Länge des zukünftigen Darm meisten der ENS wird aus einer kleinen Anfangs Pool von NCC, die eine lange Reise, um zu kolonisieren verpflichten abgeleitet. Unter mehreren Signalwege bekanntbeeinflussen ente NCC Kolonisation wird GDNF / RET-Signalisierung als wichtigste anerkannt. Tatsächlich ist zeitlich und räumlich gesteuert Sekretion des RET-Liganden GDNF durch den Darm Mesenchym vor allem für die Attraktivität und Anleitung von RET-exprimierenden ente NCC nach und in der embryonalen Darm verantwortlich. Hier beschreiben wir ein ex vivo Zellmigrationsassay unter Verwendung einer transgenen Mauslinie, die über fluoreszenzmarkierten NCC, die genaue Quantifizierung von ente NCC Migrationspotential in Gegenwart von verschiedenen Wachstumsfaktoren, einschließlich GDNF ermöglicht.

Introduction

Neuralleistenzellen (NCC) sind eine Übergangszelltyp spezifisch für Wirbeltiere, die während der Embryonalentwicklung viele Derivate bildet. Diese Zellpopulation entsteht am Rand des neuronalen Platte, benachbart zu nicht-neuralen Ektoderm 1. Während Neurulation, Biegen der Neuralplatte NCC Orten entlang der dorsalen Rand der bildenden Neuralrohr. NCC laufen dann eine epitheliale-mesenchymale Transition, Trennung und die Migration weg von dem Neuralrohr. NCC besiedeln verschiedenen embryonalen Strukturen, einschließlich des Verdauungstraktes, wo sie den gesamten enterische Nervensystem (ENS) zu bilden, ein zusammenhängendes Netzwerk von Nervenknoten in der Darmwand eingebettet. Wie kürzlich Bewertung 2,3 haben viele Gene in der Entwicklung dieser komplizierten Struktur beteiligt.

Die meisten der ENS wird aus einem kleinen Pool von NCC mit Ursprung aus dem Vagus Neuralrohr (dh rund um die potenziellen Hinterhirn / Rückenmark-Grenze) abgeleitet 4.Diese neuronalen Vorläuferzellen erreichen die Vorderdarm um embryonalen Tag (e) 9,0 bei Mäusen und dann kaudal wandern im Darm Mesenchym bis ca. EUR 15,0 um die ganze embryonalen Darm zu kolonisieren. Eine kleinere Teilmenge von Kolon neuralen Vorläuferzellen wird auch durch sakrale NCC, die den hinteren Darm in die entgegengesetzte Richtung bis zum Blinddarm 4 eindringen vorgesehen. Sowohl Vagus-und sakralen NCC erfordern mehrere migrations, Proliferation-, Überlebens-und Differenzierungsfördernde Hinweise, um vollständige Bildung des ENS zu gewährleisten. In dieser Hinsicht Tiermodellen – vor allem gentechnisch veränderte Mäuse – haben maßgeblich bei der Identifizierung von mehreren wesentlichen extrazellulären Liganden: GDNF (Glia-Zellen-derived neurotrophic factor), Endothelin-3, Neurotrophin-3, BMPs (Bone morphogenetische Proteine), Netrin sowie Sonic und Indian Hedgehog (Shh und Ihh) 10.05. Von diesen ist GDNF Signal durch die Transmembran-Rezeptor-Tyrosin-Kinase RET (während der Transfektion Rearranged) als th erkanntE kritischen Weg für die Anziehung und Führung von NCC nach und in der embryonalen Darm. GDNF ist durch den Darm ausgeschieden und Mesenchym bildet eine raumzeitlich gesteuert rosrrocaudal Gradienten, die direkt chemoattractive zu ente NCC, die ausdrücken, RET ist 11,12.

Neben anderen Funktionen steuert der ENS Bewegung im Verdauungstrakt durch seine Wechselwirkung mit der glatten Muskulatur in der Darmwand. Abwesenheit von neuralen Ganglien im Anschlussbereich der Darm Ergebnisse in Hirschsprung-Krankheit: tonische Kontraktion des betroffenen Segments führt zu Verstopfung stromauf Anhäufung von aufgeschlossenen Material und massive Ausdehnung des Darms und Bauch. Hirschsprung-Krankheit tritt in etwa einem von 5.000 Lebendgeburten. Die rostro-kaudale Migrationsmuster von magensaft NCC ist vermutlich die wichtigsten Einflussfaktor auf die Ätiologie der Hirschsprung-Krankheit sein. Der Doppelpunkt, die am weitesten von der Quelle der Migration NCC und letzte Teil Bowel besiedelt zu werden, ist besonders anfällig für Mängel in der ENS-Bildung. In Übereinstimmung mit ihrer entscheidenden Rolle bei magensaftresistenten NCC Migration ist Störung der GDNF / RET Signalisierung der Haupt bekannte genetische Ursache von Morbus Hirschsprung 13.

Um besser zu studieren, NCC und ENS Entwicklung, erzielten wir eine transgene Mauslinie – mit Namen Gata4p [5 kb]-GFP 14 -, in dem Migrations NCC mit Green Fluorescent Protein (GFP) markiert. Als nächstes perfektioniert ein ex vivo Zellmigrationsassay, durch andere Gruppen 11,12,15 aus veröffentlichten Arbeiten ausgelegt, die jetzt ermöglicht eine präzise Quantifizierung der ente NCC Migrationspotential in Gegenwart von verschiedenen Wachstumsfaktoren, wie GDNF.

Protocol

Ethik-Erklärung Experimente mit Mäusen wurden folgende Kanadischer Rat der Tierpflege-Richtlinien für die Versorgung und Manipulation von Tieren in der medizinischen Forschung durchgeführt. Protokolle, die die Manipulation der Tiere wurden von der Ethikkommission der Universität von Quebec in Montreal genehmigt (Comité institutionnel de Protection des Animaux, Referenznummer 0512-R3-650 bis 0513). 1. Herstellung von Kollagen-Gels Arb…

Representative Results

Die folgenden Ergebnisse sind repräsentativ dafür, was mit dem hier beschriebenen (1)-Technik erhalten werden. Die Verwendung von Wachstumsfaktoren (dh GDNF) stimuliert die Migration der GFP-exprimierenden ente NCC aus dem Darm in das Explantat und Kollagen-Gel (Abb. 2). Obwohl einige Zellen kommen aus dem Explantat in Abwesenheit von Wachstumsfaktoren, sind diese meist nicht GFP-markierten und für passive Eintrag. Es ist notwendig, die Scheibe von dem Darm Kollagen-Gel, um …

Discussion

Wir zeigen, wie unser Ex-vivo-Explantatkultur Technik kann verwendet werden, um genau zu quantifizieren ente NCC Migrationspotential in Gegenwart von GDNF werden. Eine solche genaue Quantifizierung wird stark durch Verwendung von 200 um dicke Vibratoms Darmstücke statt große Stücke ungefähre Größe, wie zuvor beschrieben, 11,12,15 erleichtert. Tatsächlich ermöglicht uns das mit einer angemessenen Anzahl von Zellen in einem hoch reproduzierbare Einstellung zu arbeiten. Zu beachten ist, ermögli…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Denis Flipo für die Bildverarbeitung und Analyse Beratung und David W. Silver in dessen Labor die Gata4p [5 kb]-GFP-Mauslinie generiert wurde. Die Forschung im Labor wird von Pilon CIHR, NSERC, FRQS und FRQNT finanziert.

Materials

DMEM powder Wisent 219-010-XK
NaHCO3 Bioshop SOB999 Biotechnology grade
Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron) EMD Millipore SCGP00525
Penicilin-Streptomycin solution, 100x Wisent 450-201-EL
Fetal bovine serum Wisent 095-150 High quality grade
Collagen I BD biosciences 354236
NaOH Bioshop SHY700 Diluted from 10 N stock then sterile-filtered
GDNF Cedarlane CLCYT305
Falcon 24-well Plate BD biosciences 353047
Dissecting scissors Fisher Scientific 089515
Glass Petri dish VWR 89000-306
PBS Sigma P5493 Cell culture grade
Dissecting microscope Leica M125
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-20
Agarose Bioshop AGA001 Biotechnology grade
Surgical blade Feather 21
All Purpose Instant Krazy Glue Pen Krazy Glue KG824
HM 650V Vibrating-Blade Microtome Thermo Scientific 920110
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
DAPI Sigma-Aldrich D9564

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Cite This Article
Bergeron, K., Cardinal, T., Pilon, N. A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors. J. Vis. Exp. (79), e50709, doi:10.3791/50709 (2013).

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