쥐과 장내 신경 전구 세포에 대한 양이 세포 이동의 분석
Summary
우리는 다양한 성장 인자의 존재 하에서 장용성 신경 능선 세포 이동 전위의 정확한 정량을 허용 생체 세포 이동 분석을 제시한다.
Abstract
신경 능선 세포 (NCC)는 등의 신경관에서 유래 및 개발 척추 동물의 배아에 걸쳐 광범위하게 마이그레이션 과도 다 능성 세포 집단이다. 말초 뉴런 및 아교를 제공 할뿐만 아니라, NCC는 멜라닌 세포뿐만 아니라 부교감 얼굴 골격의 대부분을 생성한다. NCC 마이그레이션 및 차별화 신경 튜브 및 지역에 별개의 세포 외 신호에 대한 노출을 따라 자신의 축 원점의 조합에 의해 제어된다. 세포 외 리간드의 이러한 기여는 장용 신경계 (ENS), 복잡한 상호 연결 (다른 것들 사이에) 로컬로 제어하는 신경 중추의 네트워크 창자 근육 운동과 장 운동의 형성시에 특히 분명하다. 꼬리 패션에 주동이의 – – 미래의 창자의 전체 길이를 ENS의 대부분은 정착하기 위해 긴 여행을 수행 NCC의 작은 초기 수영장에서 파생됩니다. 로 알려진 몇 가지 신호 전달 경로 중장내 NCC의 식민지에 영향을 미치는, GDNF / RET 신호가 가장 중요한 것으로 인식되고 있습니다. 사실, 창자의 중간 엽으로 RET 리간드 GDNF의 시공간으로 제어 분비 배아 창자 및 내 매력과 RET – 표현 장내 NCC의 안내를 주로 담당하고 있습니다. 여기, 우리는 GDNF 등 다양한 성장 인자의 존재에 장내 NCC 마이그레이션 가능성 정확한 정량화 할 수 찬란 NCC를 가진 유전자 변형 마우스 라인을 사용하고, 생체 세포 이동 분석에 대해 설명합니다.
Introduction
신경 능선 세포 (NCC)의 배아를 개발하는 동안 많은 유도체를 형성하는 척추 동물에 고유 한 과도 세포 유형입니다. 이 세포 집단이 아닌 신경 외배엽 1에 인접한 신경 판의 경계에서 발생한다. neurulation 동안, 성형 신경관의 등쪽 가장자리를 따라 신경 판의 장소 NCC의 굽힘. NCC는 분리하는 멀리 신경 튜브에서 마이그레이션, 상피 – 간엽 전환을 받고있다. NCC들은 전체 장용 신경계 (ENS)를 형성 소화관 장벽에 내장 신경 신경절의 상호 연결된 네트워크를 포함하는 다양한 배아 구조를 정착. 최근 2,3 리뷰, 많은 유전자는이 복잡한 구조의 개발에 참여하고있다.
ENS의 대부분은 (즉, 미래의 후뇌 / 척수 경계 정도) 미주 신경 튜브에서 NCC의 원래의 작은 수영장에서 파생 4.이 신경 전구 세포는 쥐의 배아 일 (E) 9.0 주위에 foregut에 도달 약 e15.0 전체 배아 창자를 식민지 때까지 용기의 중간 엽에서 꼬리 쪽 마이그레이션 할 수 있습니다. 대장의 신경 전구 세포의 작은 부분 집합은 최대 맹장 4 반대 방향으로 후방 창자 침입 성례 NCC에 의해 제공됩니다. 미주와 성례의 두 NCC가 필요 여러 마이그레이션, 핵 확산, ENS의 완전한 형성을 보장하기 위해 생존과 분화 촉진 단서.을 이와 관련, 동물 모델 – 특히 유전자 변형 생쥐는 – 여러 가지 중요한 세포 외 리간드의 식별 수단이되었습니다 GDNF (아교 세포 유래 신경 영양 인자), 엔도 텔린-3, 뉴로-3, BMP에 (뼈 형태 형성 단백질), 네트 린에게 뿐만 아니라, 음과 인도의 고슴도치 (쉬와 IHH) ~ 10. 이들 중, (형질 전환시 재 배열) 티로신 키나제 횡단 수용체 RET을 통해 신호 GDNF는 번째로 인식되고배아 창자 및 내 매력과 NCC의 지침에 대한 전자의 가장 중요한 통로. GDNF는 창자의 중간 엽에서 분비 및 RET (11, 12)을 표현 장내 NCC, 직접 chemoattractive 인 시공간으로 제어 rosrrocaudal 구배를 형성한다.
다른 기능 사이에, ENS는 장 벽에 부드러운 근육과의 상호 작용을 통해 소화 기관 내에서의 움직임을 조절한다. Hirschsprung의 질병에있는 장 결과의 말단 부위에있는 신경 중추의 부재 : 영향을받는 부분의 토닉 수축 막힘, 소화 물질의 상류 축적과 창자와 복부의 거대한 팽창에 이르게한다. Hirschsprung 병은 약 5,000 정상 출산을 발생합니다. 장내 NCC의 rostro – 꼬리 이주 패턴은 Hirschsprung의 질병의 원인에 대한 주요 기여 요인이 될 것으로 생각됩니다. NCC와 B의 마지막 부분을 마이그레이션하는 소스의 결장, 먼정착 할 owel는 ENS 형성의 결함에 가장 민감하다. 장내 NCC 마이그레이션에서의 중요한 역할에 따라, GDNF / RET 신호의 중단 Hirschsprung의 질병 (13)의 주요 알려진 유전 적 원인이다.
[5킬로바이트-GFP 14 Gata4p 이름 – – 철새 NCC는 녹색 형광 단백질 (GFP)으로 표시되는 더 나은 NCC와 ENS 개발을 연구하기 위해, 우리는 유전자 변형 마우스 라인을 생성합니다. 우리는 다음에 지금과 같은 GDNF 등의 다양한 성장 인자의 존재에 장내 NCC 마이그레이션 가능성의 정확한 정량화 할 수 있습니다 다른 그룹 11,12,15에서 출판 작업에서 적응 생체 세포 이동 분석을, 완성.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 우리의 생체 이식편 배양 기술은 정확하게 GDNF의 존재에 장내 NCC 이주 가능성을 정량화하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 이러한 정확한 정량이 크게 11,12,15 이전에 설명 된대로, 200 ㎛ 두께의 vibratome 창자 부분을 사용하는 대신 대략적인 크기의 큰 조각에 의해 촉진된다. 사실, 이것은 우리가 재현성이 높은 환경에서 세포의 적절한 수와 함께 작업 할 수 있?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 이미지 처리 및 분석 조언 데니스 워드 컨트리의 .. 감사합니다, 데이비드 W. Silversides 그의 실험실에서 Gata4p [5킬로바이트-GFP 마우스 라인이 생성되었습니다. 필론 실험실에서 연구를 CIHR, NSERC, FRQS 및 FRQNT에 의해 투자된다.
Materials
| DMEM powder | Wisent | 219-010-XK | |
| NaHCO3 | Bioshop | SOB999 | Biotechnology grade |
| Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron) | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Penicilin-Streptomycin solution, 100x | Wisent | 450-201-EL | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 095-150 | High quality grade |
| Collagen I | BD biosciences | 354236 | |
| NaOH | Bioshop | SHY700 | Diluted from 10 N stock then sterile-filtered |
| GDNF | Cedarlane | CLCYT305 | |
| Falcon 24-well Plate | BD biosciences | 353047 | |
| Dissecting scissors | Fisher Scientific | 089515 | |
| Glass Petri dish | VWR | 89000-306 | |
| PBS | Sigma | P5493 | Cell culture grade |
| Dissecting microscope | Leica | M125 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001 | Biotechnology grade |
| Surgical blade | Feather | 21 | |
| All Purpose Instant Krazy Glue Pen | Krazy Glue | KG824 | |
| HM 650V Vibrating-Blade Microtome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 |
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