En kvantitativ cellmigrationsassay för Murina Enter Neural stamfäder
Summary
Vi presenterar en ex vivo cellmigrationsassay som tillåter exakt kvantifiering av magsaftresistent neural crest cell migration potentialen i närvaro av olika tillväxtfaktorer.
Abstract
Neurallistceller (NCC) är en övergående och multicellpopulation som härstammar från den dorsala neuralröret och vandrar mycket i hela utvecklings ryggradsdjur embryot. Förutom att ge perifera glia och nervceller, NCC genererar melanocyter samt de flesta av kranio-och ansiktsskelett. NCC migration och differentiering styrs av en kombination av deras axiella ursprung längs neuralröret och deras exponering för regionalt distinkta extracellulära signaler. Sådant bidrag cellulära ligander är särskilt tydligt under bildandet av det enteriska nervsystemet (ENS), ett komplext sammankopplade nätverk av neurala ganglierna som lokalt styr (bland annat) gut muskelrörelser och intestinal motilitet. Merparten av ILE är härledd från en liten initial pool av NCC att genomföra en lång resa för att kolonisera – i en rostralt till kaudalt fashion – hela längden av den blivande tarmen. Bland flera signalvägar som är kända förpåverka enter NCC kolonisering, är GDNF / RET signalering erkänd som den viktigaste. Faktum är spatiotemporally kontrollerad utsöndring av RET liganden GDNF av tarmen mesenkymet huvudansvarig för attraktion och vägledning av RET-uttryckenter NCC och inom den embryonala tarmen. Här beskriver vi en ex vivo cell migration assay, med användning av en transgen mus linje besitter fluorescensmärkt NCC, som tillåter exakt kvantifiering av magsaftresistent NCC migrationspotentialen i närvaro av olika tillväxtfaktorer, inklusive GDNF.
Introduction
Neurallistceller (NCC) är en övergående celltyp unik för ryggradsdjur som bildar många derivat under embryoutveckling. Denna cellpopulation uppkommer vid gränsen av det neurala plattan, som gränsar till icke-neural ektoderm 1. Under neurulation, böjning av de neurala platt ställen NCC längs den dorsala kanten av formnings neuralröret. NCC genomgår sedan en epitelial-mesenkymala övergång, segregerande och migrera bort från neuralrörsdefekter. NCC kolonisera olika embryonala strukturer, bland annat mag-tarmkanalen där de bildar hela det enteriska nervsystemet (ENS), ett sammanlänkat nätverk av neurala ganglierna inbäddad i tarmväggen. Så sent omdömet 2,3 har många gener som varit inblandade i utvecklingen av denna invecklade struktur.
De flesta av ENS kommer från en liten pool av NCC har sitt ursprung från den vagala neuralrörsdefekter (dvs. runt den blivande hindbrain / ryggmärgen gränsen) 4.Dessa neurala stamceller når framtarmen kring embryonala dag (e) 9.0 i möss och sedan vandrar kaudalt i tarmen mesenkymet tills ca e15.0 att kolonisera hela embryonala tarmarna. En mindre delmängd av colonic neurala stamceller ges också av sakral NCC, som invaderar den bakre tarmen i motsatt riktning upp till cekum 4. Både vagala och sakrala NCC kräver flera migration-, spridning-, överlevnad-och differentieringsfrämjande ledtrådar för att garantera fullständig bildandet av ENS. I detta avseende djurmodeller – särskilt genetiskt modifierade möss – har varit avgörande för att identifiera flera viktiga extracellulära ligander: GDNF (gliacell-neurotrofa faktor), endotelin-3, neurotrofin-3, BMP (benmorfogena proteiner), Netrin , samt Sonic och indiska Hedgehog (Shh och Ihh) 5-10. Av dessa är GDNF signalering via tyrosinkinas membranreceptor RET (ordnas under transfektion) erkänd som the mest kritiska vägen för attraktion och ledning av NCC och inom den embryonala tarmen. GDNF utsöndras av tarmens mesenkym och bildar en spatiotemporally kontrollerad rosrrocaudal gradient som är direkt chemoattractive till enterisk NCC, som uttrycker RET 11,12.
Bland andra funktioner, ENS reglerar rörligheten inom mag-tarmkanalen genom dess interaktion med glatta muskulaturen i tarmväggen. Frånvaro av neurala ganglierna i terminala regionen i tarmen leder till Hirschsprungs sjukdom: tonisk kontraktion av den påverkade segment leder till blockering, uppströms ackumulering av digererat material och massiv uttänjning av tarmen och magen. Hirschsprungs sjukdom inträffar ungefär en i 5.000 levande födda. Den rostro-caudal migrationsmönster enter NCC tros vara den främsta bidragande faktorn till etiologin av Hirschsprungs sjukdom. Tjocktarmen, längst bort från källan att migrera NCC och sista delen av bowel att koloniseras, är mest mottagliga för defekter i ENS formation. I enlighet med sin avgörande roll i enter NCC migration, är störningar i GDNF / RET signalering den viktigaste kända genetiska orsaken till Hirschsprungs sjukdom 13.
För att bättre studera NCC och ENS utveckling, vi genererat en transgen mus linje – som heter Gata4p [5kb]-GFP 14 – där flyttande NCC är märkta med grönt fluorescerande protein (GFP). Vi fulländade bredvid ett ex vivo cellmigrationsassay, anpassat från publicerade verk av andra grupper 11,12,15, som nu ger en exakt kvantifiering av enter NCC migrationspotentialen i närvaro av olika tillväxtfaktorer, såsom GDNF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi visar hur våra ex vivo Explantation kultur teknik kan användas för att exakt kvantifiera enter NCC migrationspotentialen i närvaro av GDNF. Sådana exakta kvantifiering underlättas i hög grad genom att använda 200 nm-tjocka vibratome tarmsektioner i stället för stora bitar av ungefärlig storlek, som tidigare beskrivits 11,12,15. I själva verket kan vi genom att arbeta med ett rimligt antal celler i en mycket reproducerbar inställning. Att notera, den likformiga fördelningen av fluores…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Denis Flipo för bildbehandling och analys rådgivning, och David W. Silver i vars laboratorium för Gata4p [5kb]-GFP mus linje genererades. Forskning i Pilon laboratorium finansieras av CIHR, NSERC, FRQS och FRQNT.
Materials
| DMEM powder | Wisent | 219-010-XK | |
| NaHCO3 | Bioshop | SOB999 | Biotechnology grade |
| Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron) | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Penicilin-Streptomycin solution, 100x | Wisent | 450-201-EL | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 095-150 | High quality grade |
| Collagen I | BD biosciences | 354236 | |
| NaOH | Bioshop | SHY700 | Diluted from 10 N stock then sterile-filtered |
| GDNF | Cedarlane | CLCYT305 | |
| Falcon 24-well Plate | BD biosciences | 353047 | |
| Dissecting scissors | Fisher Scientific | 089515 | |
| Glass Petri dish | VWR | 89000-306 | |
| PBS | Sigma | P5493 | Cell culture grade |
| Dissecting microscope | Leica | M125 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001 | Biotechnology grade |
| Surgical blade | Feather | 21 | |
| All Purpose Instant Krazy Glue Pen | Krazy Glue | KG824 | |
| HM 650V Vibrating-Blade Microtome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 |
References
- Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).
- Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. The developmental genetics of Hirschsprung’s disease. Clin. Genet. 83 (1), 15-22 (2013).
- Obermayr, F., Hotta, R., Enomoto, H., Young, H. M. Development and developmental disorders of the enteric nervous system. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 10 (1), 43-57 (2012).
- Sasselli, V., Pachnis, V., Bursn, A. J. The enteric nervous system. Dev. Biol. 366 (1), 64-73 (2012).
- Sanchez, M. P., Silos-Santiago, I., et al. Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF. Nature. 382 (6586), 70-73 (1996).
- Baynash, A. G., Hosoda, K., et al. Interaction of endothelin-3 with endothelin-B receptor is essential for development of epidermal melanocytes and enteric neurons. Cell. 79 (7), 1277-1285 (1994).
- Chalazonitis, A., Pham, T. D., et al. Neurotrophin-3 is required for the survival-differentiation of subsets of developing enteric neurons. J. Neurosci. 21 (15), 5620-5636 (2001).
- Goldstein, A. M., Brewer, K. C., Doyle, A. M., Nagy, N., Roberts, D. J. BMP signaling is necessary for neural crest cell migration and ganglion formation in the enteric nervous system. Mech. Dev. 122 (6), 821-833 (2005).
- Jiang, Y., Liu, M. T., Gershon, M. D. Netrins and DCC in the guidance of migrating neural crest-derived cells in the developing bowel and pancreas. Dev. Biol. 258 (2), 364-384 (2003).
- Ramalho-Santos, M., Melton, D. A., McMahon, A. P. Hedgehog signals regulate multiple aspects of gastrointestinal development. Development. 127 (12), 2763-2772 (2000).
- Natarajan, D., Marcos-Gutierrez, C., Pachnis, V., de Graaf, E. Requirement of signaling by receptor tyrosine kinase RET for the directed migration of enteric nervous system progenitor cells during mammalian embryogenesis. Development. 129 (22), 5151-5160 (2002).
- Young, H. M., Hearn, C. J., et al. GDNF Is a chemoattractant for enteric neural cells. Dev. Biol. 229 (2), 503-516 (2001).
- Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J. Med. Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
- Pilon, N., Raiwet, D., Viger, R. S., Silversides, D. W. Novel pre- and post-gastrulation expression of Gata4 within cells of the inner cell mass and migratory neural crest cells. Dev. Dyn. 237 (4), 1133-1143 (2008).
- Nagy, N., Goldstein, A. M. Endothelin-3 regulates neural crest cell proliferation and differentiation in the hindgut enteric nervous system. Dev. Biol. 293 (1), 203-217 (2006).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersen, K., Behringer, R. . Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , 209-250 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Byth, K. F., Thomas, A., et al. AZD5438, a potent oral inhibitor of cyclin-dependent kinases 1, 2, and 9, leads to pharmacodynamic changes and potent antitumor effects in human tumor xenografts. Mol. Cancer Ther. 8 (7), 1856-1866 (2009).
