Murine आंत्र तंत्रिका progenitors के लिए एक मात्रात्मक सेल प्रवासन परख
Summary
हम विभिन्न विकास कारकों की उपस्थिति में आंतों का तंत्रिका शिखा सेल प्रवास संभावित की सटीक मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है कि एक पूर्व vivo सेल प्रवास परख उपस्थित थे.
Abstract
तंत्रिका शिखा कोशिकाओं (एनसीसी) पृष्ठीय न्यूरल ट्यूब से निकलती है और विकासशील हड्डीवाला भ्रूण भर में बड़े पैमाने पर प्रवास करती है कि एक क्षणिक और multipotent सेल की आबादी हैं. परिधीय glia और न्यूरॉन्स प्रदान करने के अलावा, एनसीसी melanocytes के साथ ही cranio चेहरे कंकाल की सबसे उत्पन्न करते हैं. एनसीसी प्रवास और भेदभाव न्यूरल ट्यूब और क्षेत्रीय स्तर पर अलग बाह्य cues के लिए जोखिम के साथ उनके अक्षीय मूल के संयोजन के द्वारा नियंत्रित किया जाता है. बाह्य ligands के इस तरह के योगदान आंतों का तंत्रिका तंत्र (सत्ता), एक जटिल परस्पर (अन्य बातों के अलावा) स्थानीय रूप से नियंत्रित करता है कि तंत्रिका ganglia के नेटवर्क पेट की मांसपेशी आंदोलन और आंतों की गतिशीलता के गठन के दौरान विशेष रूप से स्पष्ट है. दुम फैशन के लिए एक विजय – स्तम्भ में – – भावी पेट की पूरी लंबाई के सत्ता से अधिकांश उपनिवेश स्थापित करने के क्रम में एक लंबी यात्रा शुरू करने कि एनसीसी के एक छोटे से प्रारंभिक पूल से ली गई है. ज्ञात करने के लिए कई संकेत दे रास्ते के बीच मेंआंतों का एनसीसी बसाना को प्रभावित, GDNF / रेत संकेतन सबसे महत्वपूर्ण माना जाता है. दरअसल, पेट mesenchyme से रेत ligand GDNF की spatiotemporally नियंत्रित स्राव भ्रूण पेट के लिए और भीतर आकर्षण और रेत व्यक्त आंतों का एनसीसी के मार्गदर्शन के लिए मुख्यत: जिम्मेदार है. यहाँ, हम GDNF सहित विभिन्न विकास कारकों की उपस्थिति में आंतों का एनसीसी प्रवास संभावित की सटीक मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है जो fluorescently लेबल एनसीसी, जिनके पास एक ट्रांसजेनिक माउस लाइन का इस्तेमाल कर रही है, एक पूर्व vivo सेल प्रवास परख का वर्णन.
Introduction
तंत्रिका शिखा कोशिकाओं (एनसीसी) भ्रूण के विकास के दौरान कई डेरिवेटिव रूपों कि रीढ़ के लिए अद्वितीय एक क्षणिक सेल प्रकार के होते हैं. इस सेल की आबादी गैर तंत्रिका बाहरी झिल्ली 1 से सटे तंत्रिका प्लेट, की सीमा पर उठता है. Neurulation के दौरान गठन न्यूरल ट्यूब के पृष्ठीय बढ़त के साथ तंत्रिका प्लेट स्थानों एनसीसी के झुकने. एनसीसी तो segregating और दूर न्यूरल ट्यूब से पलायन, एक उपकला-mesenchymal संक्रमण से गुजरना. एनसीसी वे पूरे आंतों का तंत्रिका तंत्र (सत्ता) के रूप में जहां पाचन तंत्र, आंतों की दीवारों में एम्बेडेड तंत्रिका ganglia के एक परस्पर नेटवर्क सहित विभिन्न भ्रूण संरचनाओं, उपनिवेश. हाल ही में 2,3 की समीक्षा की है, कई जीनों इस जटिल संरचना के विकास में शामिल किया गया है.
सत्ता के अधिकांश (यानी भावी पश्चमस्तिष्क / रीढ़ की हड्डी की सीमा के आसपास) vagal तंत्रिका ट्यूब से एनसीसी उद्भव के एक छोटे से पूल से ली गई है 4.इन तंत्रिका progenitors चूहों में भ्रूण दिन (ई) 9.0 चारों ओर अग्रांत्र तक पहुँचने और लगभग e15.0 पूरे भ्रूण आंतों उपनिवेश स्थापित करने के लिए जब तक तो पेट mesenchyme भीतर दुमदारी विस्थापित. Colonic तंत्रिका progenitors के एक नाबालिग सबसेट भी ऊपर अंधान्त्र 4 को विपरीत दिशा में पीछे पेट पर आक्रमण जो त्रिक एनसीसी द्वारा प्रदान की जाती है. Vagal और धार्मिक दोनों एनसीसी की आवश्यकता एकाधिक प्रवास, प्रसार, सत्ता के पूर्ण गठन को सुनिश्चित करने के अस्तित्व और भेदभाव को बढ़ावा देने cues. इस संबंध में पशु मॉडल – विशेष रूप से आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों – कई आवश्यक बाह्य ligands की पहचान करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है: GDNF (glial सेल व्युत्पन्न neurotrophic कारक), Endothelin -3, neurotrophin -3, BMPs (हड्डी morphogenic प्रोटीन), Netrin , साथ ही ध्वनि और भारतीय हाथी (श्श्श और IHH) 5-10. इनमें से, (अभिकर्मक के दौरान पुन: व्यवस्थित) tyrosine kinase transmembrane रिसेप्टर रेत के माध्यम से संकेत GDNF वें के रूप में मान्यता प्राप्त हैभ्रूण पेट के लिए और भीतर आकर्षण और एनसीसी के मार्गदर्शन के लिए ई सबसे महत्वपूर्ण मार्ग है. GDNF पेट mesenchyme द्वारा स्रावित और रेत 11,12 व्यक्त जो आंतों का एनसीसी, को सीधे chemoattractive है कि एक spatiotemporally नियंत्रित rosrrocaudal ढाल रूपों है.
अन्य कार्यों के बीच, सत्ता आंतों की दीवारों में चिकनी मांसपेशियों के साथ अपनी बातचीत के माध्यम से पाचन तंत्र के भीतर आंदोलन को नियंत्रित करता है. हिर्स्चस्प्रुंग रोग में आंतें परिणाम के टर्मिनल क्षेत्र में तंत्रिका ganglia का अभाव: प्रभावित खंड का टॉनिक संकुचन रुकावट पच सामग्री के अपस्ट्रीम संचय और आंत और पेट का भारी बढ़ाव की ओर जाता है. हिर्स्चस्प्रुंग रोग लगभग एक 5000 में जीवित जन्म होता है. आंतों का एनसीसी की rostro दुम प्रवास पैटर्न हिर्स्चस्प्रुंग रोग के एटियलजि के लिए मुख्य योगदान कारक माना जा रहा है. एनसीसी और बी के अंतिम भाग की ओर पलायन के स्रोत से पेट के, दूरउपनिवेश होने के लिए owel, सत्ता के गठन में दोष के सबसे अतिसंवेदनशील है. आंतों का एनसीसी प्रवास में अपनी महत्वपूर्ण भूमिका के अनुसार, GDNF / रेत संकेतन का विघटन हिर्स्चस्प्रुंग रोग 13 की मुख्य ज्ञात आनुवंशिक कारण है.
[5kb]-GFP 14 Gata4p नाम – – प्रवासी एनसीसी हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के साथ चिह्नित कर रहे हैं, जिसमें बेहतर एनसीसी और सत्ता के विकास का अध्ययन करने के लिए, हम एक ट्रांसजेनिक माउस लाइन उत्पन्न. हम अगले अब GDNF जैसे विभिन्न विकास कारकों की उपस्थिति में आंतों का एनसीसी प्रवास संभावित की सटीक मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है कि अन्य समूहों 11,12,15 द्वारा प्रकाशित काम से रूपांतरित एक पूर्व vivo सेल प्रवास परख,, सिद्ध.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम अपने पूर्व vivo explant संस्कृति तकनीक ठीक GDNF की उपस्थिति में आंतों का एनसीसी प्रवास संभावित यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे दिखा. इस तरह की सटीक मात्रा का ठहराव बहुत पहले से 11,12,15 वर्णित के ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इमेज प्रोसेसिंग और विश्लेषण सलाह के लिए डेनिस Flipo धन्यवाद, और डेविड डब्ल्यू Silversides जिसका प्रयोगशाला में Gata4p [5kb]-GFP माउस लाइन उत्पन्न किया गया था. Pilon प्रयोगशाला में रिसर्च CIHR, NSERC, FRQS और FRQNT द्वारा वित्त पोषित है.
Materials
| DMEM powder | Wisent | 219-010-XK | |
| NaHCO3 | Bioshop | SOB999 | Biotechnology grade |
| Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron) | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Penicilin-Streptomycin solution, 100x | Wisent | 450-201-EL | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 095-150 | High quality grade |
| Collagen I | BD biosciences | 354236 | |
| NaOH | Bioshop | SHY700 | Diluted from 10 N stock then sterile-filtered |
| GDNF | Cedarlane | CLCYT305 | |
| Falcon 24-well Plate | BD biosciences | 353047 | |
| Dissecting scissors | Fisher Scientific | 089515 | |
| Glass Petri dish | VWR | 89000-306 | |
| PBS | Sigma | P5493 | Cell culture grade |
| Dissecting microscope | Leica | M125 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001 | Biotechnology grade |
| Surgical blade | Feather | 21 | |
| All Purpose Instant Krazy Glue Pen | Krazy Glue | KG824 | |
| HM 650V Vibrating-Blade Microtome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 |
References
- Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).
- Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. The developmental genetics of Hirschsprung’s disease. Clin. Genet. 83 (1), 15-22 (2013).
- Obermayr, F., Hotta, R., Enomoto, H., Young, H. M. Development and developmental disorders of the enteric nervous system. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 10 (1), 43-57 (2012).
- Sasselli, V., Pachnis, V., Bursn, A. J. The enteric nervous system. Dev. Biol. 366 (1), 64-73 (2012).
- Sanchez, M. P., Silos-Santiago, I., et al. Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF. Nature. 382 (6586), 70-73 (1996).
- Baynash, A. G., Hosoda, K., et al. Interaction of endothelin-3 with endothelin-B receptor is essential for development of epidermal melanocytes and enteric neurons. Cell. 79 (7), 1277-1285 (1994).
- Chalazonitis, A., Pham, T. D., et al. Neurotrophin-3 is required for the survival-differentiation of subsets of developing enteric neurons. J. Neurosci. 21 (15), 5620-5636 (2001).
- Goldstein, A. M., Brewer, K. C., Doyle, A. M., Nagy, N., Roberts, D. J. BMP signaling is necessary for neural crest cell migration and ganglion formation in the enteric nervous system. Mech. Dev. 122 (6), 821-833 (2005).
- Jiang, Y., Liu, M. T., Gershon, M. D. Netrins and DCC in the guidance of migrating neural crest-derived cells in the developing bowel and pancreas. Dev. Biol. 258 (2), 364-384 (2003).
- Ramalho-Santos, M., Melton, D. A., McMahon, A. P. Hedgehog signals regulate multiple aspects of gastrointestinal development. Development. 127 (12), 2763-2772 (2000).
- Natarajan, D., Marcos-Gutierrez, C., Pachnis, V., de Graaf, E. Requirement of signaling by receptor tyrosine kinase RET for the directed migration of enteric nervous system progenitor cells during mammalian embryogenesis. Development. 129 (22), 5151-5160 (2002).
- Young, H. M., Hearn, C. J., et al. GDNF Is a chemoattractant for enteric neural cells. Dev. Biol. 229 (2), 503-516 (2001).
- Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J. Med. Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
- Pilon, N., Raiwet, D., Viger, R. S., Silversides, D. W. Novel pre- and post-gastrulation expression of Gata4 within cells of the inner cell mass and migratory neural crest cells. Dev. Dyn. 237 (4), 1133-1143 (2008).
- Nagy, N., Goldstein, A. M. Endothelin-3 regulates neural crest cell proliferation and differentiation in the hindgut enteric nervous system. Dev. Biol. 293 (1), 203-217 (2006).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersen, K., Behringer, R. . Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , 209-250 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Byth, K. F., Thomas, A., et al. AZD5438, a potent oral inhibitor of cyclin-dependent kinases 1, 2, and 9, leads to pharmacodynamic changes and potent antitumor effects in human tumor xenografts. Mol. Cancer Ther. 8 (7), 1856-1866 (2009).
