Att upptäcka, Visualisering och kvantifiering Generation av reaktiva syreradikaler i en Amoeba modellsystem

Summary

Vi anpassade en uppsättning protokoll för mätning av reaktiva syreradikaler (ROS) som kan tillämpas i olika amöba och däggdjurs cellulära modeller för kvalitativa och kvantitativa studier.

Abstract

Reaktiva syreradikaler (ROS) omfattar en rad reaktiva och kortlivade, syreinnehållande molekyler, som dynamiskt interkonverteras eller elimineras antingen katalytiskt eller spontant. På grund av den korta livslängden för de flesta ROS och mångfalden av sina källor och subcellulära lokaliseringar, kan en fullständig bild erhållas endast genom noggranna mätningar med hjälp av en kombination av protokoll. Här presenterar vi en uppsättning av tre olika protokoll att använda OxyBurst Grön (OBG)-belagda kulor, eller dihydroethidium (DHE) och Amplex UltraRed (AUR), för att kvalitativt och kvantitativt övervaka olika ROS i professionella fagocyter såsom Dictyostelium. Vi optimerat Pärlorna beläggningsförfaranden och begagnade OBG-belagda pärlor och live-mikroskopi för att dynamiskt visualisera intraphagosomal ROS generation på enskild cellnivå. Vi identifierade lipopolysackarid (LPS) från E. coli som en potent stimulator för ROS generation i Dictyostelium. Dessutom har vi developed realtid, medel throughput analyser med hjälp av DHE och AUR att kvantitativt mäta intracellulär superoxid och extracellulärt _{H2O 2} produktion, respektive.

Introduction

Reaktiva syreradikaler (ROS) är involverade i en mängd olika biologiska processer såsom värdförsvar, signalering, vävnadsutveckling och svar på skada samt högt blodtryck och cancer. Den väl studerade phagosomal NADPH-oxidas maskiner är tillägnad snabb ROS generation, kallad oxidativ burst, för att döda bakterier som intas i neutrofiler "phagosomes ^1. Dessutom har läckage av elektroner som en biprodukt av den mitokondriella andningskedjan tidigare trott för att vara ansvarig endast för en oreglerad källa till ROS. Men nyligen har det identifierats som en viktig mekanism för att bidra till intraphagosomal dödandet av bakterier i musmakrofager ^2. Under de senaste åren har den sociala amöba, Dictyostelium, blir en kraftfull och populär modell för att studera cell inneboende mekanismer i det medfödda immunsvaret. Faktum Dictyostelium och mänskliga fagocyter delar en förvånansvärt hög nivå av bevarande i molecular maskinerier ansvariga för bakterier avkänning, omvälvning och dödar ^3,4. De homologer av proteiner och enzymer som rör ROS produktion eller avgiftning, såsom NADPH oxidaser, kata, superoxiddismutaser, kan finnas i både mänskliga och Dictyostelium. Som bäst studerade amöba, Dictyostelium presenterar flera unika fördelar jämfört med däggdjur modellsystem. De växer vid rumstemperatur utan behov av CO _2, med en dubbleringstid av 8-10 timmar. De kan lätt hållas så vidhäftande eller suspensionskulturer. Dessutom, tack vare sin helt sekvense och kommenterad haploidgenom, och till enkel genetisk manipulation, har Dictyostelium blivit en mycket attraktiv experimentell modellorganism.

I tidigare studier, olika klorerade och fluorerade derivat av fluorescein (kollektivt kallas OxyBurst Green, OBG) som avger fluorescens efter oxidation av ROS, har använt som en ROS reporter. Cell-permeant esterified derivat används för att mäta cytoplasma ROS, medan cell impermeant dextran-eller protein-kopplade derivat används för att mäta extracellulära ROS. I synnerhet har OBG BSA-belagda pärlor redan använts för att detektera phagosomal ROS-produktion i däggdjursceller ^5. Däremot kan den mikroplattläsare synsätt bara ge ett genomsnitt ROS generation kurva från en population av celler. Med det nuvarande protokollet, med hjälp av Dictyostelium, en professionell phagocyte och optimerade experimentella förhållanden, vi får en stabil och effektiv fagocytos utan att konjugera någon opsonin på pärlorna. DHE har använts i olika modellsystem, såsom däggdjurs neutrofiler och makrofager, för att detektera ROS-produktionen ^6-9. Samtidigt finns det en del kontroverser över specificiteten och känsligheten för metoden ^8,10. Som en förbättrad version av Amplex Red, fluorescensintensiteten hos AUR är mindre känslig för pH, vilket gör det mer lämpligt för att mätaROS i nonneutral eller svagt sura miljöer. AUR har nyligen tillämpats i flera däggdjurssystem ^11,12, men dess användning i nonmammalian modeller, som ofta kräver svagt surt tillväxtmedier, har inte rapporterats ännu. Dessutom finns det inga publicerade protokollet för att kvantitativt och dynamiskt mäta ROS produktion och lokalisering i sociala amöba Dictyostelium.

Målet med den presenterade uppsättning protokoll är att ge en enkel och mångsidig lösning för att övervaka olika ROS och deras lokalisering, och vidare ge insikter i ROS-relaterade cellulära mekanismer. För OBG analysen använde vi lever mikroskopi för att övervaka hela processen med phagosomal ROS generation efter upptag av OBG-belagda kulor av Dictyostelium celler, och som en ny metod för att studera mekanismen för intraphagosomal dödandet av bakterier. Vi har optimerat medel genomströmning DHE och AUR analyser i Dictyostelium, för att mäta intracellulära Superoxide och extracellulär _{H2O 2} produktion, respektive, genom att använda LPS som en potent ROS stimulator. Observera att LPS nyligen visat sig öka den antibakteriella effekten av Dictyostelium mot fagocyteras bakterier ^13. Vidare behandling med DEDTC och katalas uttryckligen bekräftat att dessa två metoder mäter specifikt olika typer och subcellulära lokaliseringar av ROS i Dictyostelium. Slutligen kan OBG analysen anpassas till alla vidhäftande fagocytisk cell, genom att ytterligare opsoniserande pärlorna med ligander för fagocytiska receptorer av djurceller. I princip kan de DHE och AUR analyser också finjusteras för mätningar i fastsittande eller nonadherent cell under lämpliga experimentella förhållanden.

Protocol

1. Visualisering och Kvalitativ Mätning av ROS Produktion i phagosomes De OBG-belagda kulor bör förberedas i förväg. Pärlorna beläggningsförfaranden och agar overlay teknik är anpassade från publicerade referenser 5,14. Tillsätt 1 ml suspension av 3,0 ^ m karboxylerade kiseldioxidpärlor (ca 1,8 x 10 9 pärlor) i ett 1,5 ml rör, tvätta pärlorna 3 gånger med 1 ml PBS genom snabb dragning och virvling. Återsuspendera pärlorna i 1 ml P…

Representative Results

Genereringen av ROS i phagosomes kan visualiseras kvalitativt och dynamiskt genom mikroskopi (File S1). Den röda fluorescens som emitteras av Alexa Fluor 594 är pH-okänslig och förblir konstant i phagosomal miljön, medan oxidation av OBG ökar dess fluorescens i den gröna kanalen. Den emissionsspektra för in vitro-oxiderade och icke-oxiderad OBG-belagda pärlor jämförs i Figur 1B visar en signifikant ökning i intensitet efter oxidation. För att underlätta visualiser…

Discussion

Jämfört med de tidigare beskrivna metoderna, OBG-analysen visualiserar dynamiskt processen för phagosomal ROS-generering vid den enda cellnivå, i stället för att mäta en genomsnittlig ROS-signal från en population av celler. Sådana befolkningsmedelvärdes metoder tenderar att skymma viktig information som orsakas av osynkron fagocytos. Vi framgångsrikt anpassat DHE och AUR analyser till Dictyostelium och optimerade protokollen. Viktigast av allt, vi specificerade typerna och subcellulära lokalisering…

Materials

			REAGENTS
OxyBURST Green H2HFF BSA	Invitrogen	O-13291
Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-20004
Carboxylated silica beads	Kisker Biotech	PSi-3.0COOH
HL5C medium	ForMedium	HLC0102
LoFlo medium	ForMedium	LF1001
Bacto agar	BD	204010
Dihydroethidium	Sigma	37291-25MG
Amplex UltraRed	Invitrogen	A36006
Horseradish peroxidase	Roche	10108090001
Diethyldithiocarbamate (DEDTC)	Sigma	D3506-100G
Catalase	Sigma	C9322-1G
Cyanamide	Sigma	187364-25G
Lipopolysaccharides	Sigma	L2630-25G
			EQUIPMENT
ibidi μ-Dish 35 mm, high	ibidi	81156	Bottom made of optically clear plastic
MatTek dish 35 mm	MatTek corporation	P35G-1.5-14-C	Bottom made of a glass coverslip
Scepter Cell Counter	Merck Millipore	PHCC00000
White 96 well plate	Nunc	236108
Centrifuge	SORVALL	Legend RT
Microplate reader	BioTek	Synergy Mx