كشف، تصور وQuantitating الجيل من أنواع الاكسجين التفاعلية في النظام النموذجي الاميبا
Summary
نحن تكييفها مجموعة من البروتوكولات لقياس أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) التي يمكن تطبيقها في مختلف النماذج الخلوية الاميبا والثدييات للدراسات النوعية والكمية.
Abstract
تشمل أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) مجموعة من، المحتوية على الأوكسجين الجزيئات المتفاعلة وقصيرة الأجل، والتي interconverted أو القضاء عليها إما بشكل عفوي أو حفاز حيوي. ويرجع ذلك إلى فترات حياة قصيرة لمعظم ROS وتنوع مصادرها وتعريب التحت خلوية، ويمكن الحصول على صورة كاملة إلا من خلال قياسات حذرا باستخدام مزيج من البروتوكولات. هنا، فإننا نقدم مجموعة من ثلاثة بروتوكولات مختلفة باستخدام OxyBurst الأخضر (OBG) المغلفة الخرز، أو dihydroethidium (DHE) وAmplex UltraRed (اور)، لمراقبة النوعية والكمية ROS مختلفة في البالعات المهنية مثل Dictyostelium. نحن الأمثل حبات إجراءات طلاء وتستخدم حبات OBG المغلفة والمجهري الحية لتصور حيوي intraphagosomal الجيل ROS على مستوى خلية واحدة. حددنا عديد السكاريد الشحمي (LPS) من E. القولونية باعتباره مشجعا قويا لتوليد ROS في Dictyostelium. بالإضافة إلى ذلك، فإننا دeveloped الوقت الحقيقي، المقايسات المتوسطة الإنتاجية باستخدام DHE واور لقياس كميا الفائق داخل الخلايا وخارج الخلية H 2 O 2 الإنتاج، على التوالي.
Introduction
وتشارك أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) في مجموعة متنوعة واسعة من العمليات البيولوجية مثل الدفاع المضيف، إشارات، وتطوير الأنسجة واستجابة لإصابات فضلا عن ارتفاع ضغط الدم والسرطان. تحرص مدروسة phagosomal NADPH آلات أوكسيديز إلى جيل ROS السريع، والمعروفة باسم انفجار الأكسدة، لقتل البكتيريا بلعها في phagosomes العدلات '1. بالإضافة إلى ذلك، تسرب الإلكترونات كمنتج ثانوي من السلسلة التنفسية الميتوكوندريا كان يعتقد في السابق أن تكون المسؤولة الوحيدة عن مصدر غير المنظم من ROS. لكن في الآونة الأخيرة، تم التعرف عليه باعتباره آلية هامة للمساهمة في قتل البكتيريا intraphagosomal في الضامة الماوس 2. في السنوات الأخيرة، والاميبا الاجتماعية، Dictyostelium، أصبح نموذجا قوية وشعبية لدراسة آليات الجوهرية خلية من الاستجابة المناعية الفطرية. في الواقع، Dictyostelium والبالعات الإنسان مشاركة على مستوى عال من المستغرب من الحفظ في البيولوجياص الأجهزة المسؤولة عن البكتيريا الاستشعار عن بعد، مما أسفر عن مقتل والإحاطة 3،4. وhomologs من البروتينات والإنزيمات المتصلة بالإنتاج ROS أو إزالة السموم، مثل oxidases NADPH، catalases، dismutases الفائق، يمكن العثور عليها في كل من الإنسان وDictyostelium. كما الاميبا أفضل درس، Dictyostelium يقدم العديد من المزايا الفريدة على النظام النموذجي الثدييات. أنها تنمو في درجة حرارة الغرفة دون الحاجة إلى CO 2، مع مضاعفة الوقت من 8-10 ساعة. أنها يمكن أن تبقى بسهولة كما الثقافات ملتصقة أو تعليق. بالإضافة إلى ذلك، بفضل تسلسل الجينوم بالكامل والمشروح بهم فرداني، والتلاعب الجيني سهلة، أصبح Dictyostelium نموذج تجريبي جذابة للغاية الحي.
في الدراسات السابقة، ومختلف المشتقات المكلورة والمفلورة من فلوريسئين (التي تعرف باسم OxyBurst الأخضر، OBG) التي تنبعث مضان بعد الأكسدة التي كتبها ROS، وقد استخدمت كمراسلة ROS. خلية نفيذ بتوقيت شرق الولايات المتحدةوتستخدم المشتقات erified لقياس حشوية ROS، في حين تستخدم ديكستران أو مشتقات البروتين يقترن خلية impermeant لقياس خارج الخلية ROS. على وجه الخصوص، وقد تم بالفعل استخدام الخرز OBG BSA المغلفة للكشف عن إنتاج ROS phagosomal في خلايا الثدييات 5. ومع ذلك، يمكن أن النهج القائم على قارئ صفيحة ميكروسكوبية تعطي فقط بلغ متوسط منحنى الجيل ROS من السكان من الخلايا. مع هذا البروتوكول، وذلك باستخدام Dictyostelium، وهو بلعمية المهنية، وتحسين ظروف تجريبية، ونحن الحصول البلعمة مستقرة وفعالة دون أي التصريف طاهية على الخرز. وقد استخدم DHE في نظم نموذج مختلف، مثل العدلات الثدييات والضامة، للكشف عن إنتاج ريوس 6-9. وفي الوقت نفسه، هناك بعض الجدل حول خصوصية وحساسية الأسلوب 8،10. بوصفها نسخة محسنة من Amplex الأحمر، وكثافة مضان من اور هي أقل حساسية لدرجة الحموضة، مما يجعله أكثر ملاءمة لقياسROS في الأوساط الحمضية أو nonneutral ضعيفة. وقد تم تطبيق اور مؤخرا في عدة أنظمة الثدييات 11،12، ولكن لم يتم الإبلاغ عن استخدامها في نماذج nonmammalian، والتي في كثير من الأحيان تتطلب وسائط النمو حمضية ضعيفة، حتى الآن. بالإضافة إلى ذلك، ليس هناك بروتوكول لنشر كميا وحيوي قياس إنتاج ريوس والتعريب في الاميبا الاجتماعية Dictyostelium.
الهدف من مجموعة قدمت من البروتوكولات هو توفير حل سهل وتنوعا لرصد مختلف ROS والتوطين، وإعطاء مزيد من ونظرة ثاقبة الآليات الخلوية المرتبطة ROS-. لفحص OBG، استخدمنا المجهر الحية لمراقبة العملية برمتها من الجيل phagosomal ROS بعد امتصاص من الخرز OBG المغلفة من قبل خلايا Dictyostelium، وقدمت نهجا جديدا لدراسة آلية القتل intraphagosomal من البكتيريا. قمنا الأمثل المتوسطة الإنتاجية وDHE اور المقايسات في Dictyostelium، لقياس superox داخل الخلايابيئة تطوير متكاملة وخارج الخلية H 2 O 2 الإنتاج، على التوالي، وذلك باستخدام LPS باعتبارها ROS مشجعا قويا. نلاحظ أن LPS وقد تبين مؤخرا لزيادة النشاط جراثيم من البكتيريا المبتلعة Dictyostelium نحو 13. بالإضافة إلى ذلك، مع العلاج DEDTC والكاتالاز أكد صراحة أن هاتين الطريقتين تحديدا قياس أنواع مختلفة وتعريب التحت خلوية من ROS في Dictyostelium. أخيرا، يمكن تكييفها مقايسة OBG إلى أي خلية أكلة ملتصقة، من خلال مزيد من opsonizing الخرز مع يغاندس لمستقبلات البلعمية من الخلايا الحيوانية. من حيث المبدأ، يمكن للDHE واور المقايسات أيضا يكون على ما يرام ضبطها لقياس في أي خلية ملتصقة أو غير ملتصق تحت ظروف تجريبية مناسبة.
Protocol
Representative Results
Discussion
بالمقارنة مع الأساليب المذكورة سابقا، وفحص OBG يتصور حيوي في عملية phagosomal الجيل ROS على مستوى خلية واحدة، بدلا من قياس متوسط إشارة ROS من السكان من الخلايا. مثل هذه الأساليب السكان المتوسط تميل إلى حجب المعلومات الهامة التي تسببها البلعمة nonsynchronous. نحن تكييفها بنجاح…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن ممتنون لالدكاترة كارل هاينز كراوس وفنسنت JAQUET طلبا للمساعدة والمشورة لإعداد هذه البروتوكولات، ونشكر أيضا كريستوف باور وجيروم Bosset من منهاج Bioimaging من NCCR والدكتور نافين Gopaldass للحصول على الدعم التقني. ويدعم هذا البحث من خلال منحة ProDoc من مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية.
Materials
| REAGENTS | |||
| OxyBURST Green H2HFF BSA | Invitrogen | O-13291 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-20004 | |
| Carboxylated silica beads | Kisker Biotech | PSi-3.0COOH | |
| HL5C medium | ForMedium | HLC0102 | |
| LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
| Bacto agar | BD | 204010 | |
| Dihydroethidium | Sigma | 37291-25MG | |
| Amplex UltraRed | Invitrogen | A36006 | |
| Horseradish peroxidase | Roche | 10108090001 | |
| Diethyldithiocarbamate (DEDTC) | Sigma | D3506-100G | |
| Catalase | Sigma | C9322-1G | |
| Cyanamide | Sigma | 187364-25G | |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L2630-25G | |
| EQUIPMENT | |||
| ibidi μ-Dish 35 mm, high | ibidi | 81156 | Bottom made of optically clear plastic |
| MatTek dish 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | Bottom made of a glass coverslip |
| Scepter Cell Counter | Merck Millipore | PHCC00000 | |
| White 96 well plate | Nunc | 236108 | |
| Centrifuge | SORVALL | Legend RT | |
| Microplate reader | BioTek | Synergy Mx |
References
- Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology. Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).
- West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472, 476-480 (2011).
- Fey, P., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Franke, J., Chisholm, R. L. dictyBase and the Dicty Stock Center. Methods Mol. Biol. 346, 51-74 (2006).
- Basu, S., et al. dictyBase 2013: integrating multiple Dictyostelid species. Nucleic Acids Res. 41, 676-683 (2013).
- VanderVen, B. C., Yates, R. M., Russell, D. G. Intraphagosomal measurement of the magnitude and duration of the oxidative burst. Traffic. 10, 372-378 (2009).
- Cohn, C. A., Simon, S. R., Schoonen, M. A. Comparison of fluorescence-based techniques for the quantification of particle-induced hydroxyl radicals. Part. Fibre Toxicol. 5, 2 (2008).
- Snyrychova, I., Ayaydin, F., Hideg, E. Detecting hydrogen peroxide in leaves in vivo – a comparison of methods. Physiol. Plant. 135, 1-18 (2009).
- Rodrigues, J. V., Gomes, C. M. Enhanced superoxide and hydrogen peroxide detection in biological assays. Free Radic. Biol. Med. 49, 61-66 (2010).
- Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. Analysis of Kinetics of Dihydroethidium Fluorescence with Superoxide Using Xanthine Oxidase and Hypoxanthine Assay. Ann. Biomed. Eng. , (2012).
- Lee, C. W., Chen, Y. C., Ostafin, A. The accuracy of Amplex Red assay for hydrogen peroxide in the presence of nanoparticles. J. Biomed. Nanotechnol. 5, 477-485 (2009).
- Guimaraes-Ferreira, L., et al. Short-term creatine supplementation decreases reactive oxygen species content with no changes in expression and activity of antioxidant enzymes in skeletal muscle. Eur. J. Appl. Physiol. 112, 3905-3911 (2012).
- Peng, D., et al. Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells. Gut. 61, 1250-1260 (2012).
- Walk, A., et al. Lipopolysaccharide enhances bactericidal activity in Dictyostelium discoideum cells. Dev. Comp. Immunol. 35, 850-856 (2011).
- Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis. Methods Cell Biol. 28, 347-356 (1987).
- Fey, P., Kowal, A. S., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Chisholm, R. L. Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum. Nat. Protoc. 2, 1307-1316 (2007).
- Bloomfield, G., Pears, C. Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium. J. Cell. Sci. 116, 3387-3397 (2003).
- Dieckmann, R., Gopaldass, N., Escalera, C., Soldati, T., Deretic, V. Autophagosomes and Phagosomes. Methods in Molecular Biology. 445, 317-328 (2008).
- Amir, Y., Edward, O. -. A., Utpal, B. A protocol for in vivo detection of reactive oxygen species. Proto. Exch. , (2008).
- Neuhaus, E. M., Soldati, T. A myosin I is involved in membrane recycling from early endosomes. J. Cell Biol. 150, 1013-1026 (2000).
