تقييم ما قبل السريرية من التيروزين كيناز مثبطات لعلاج اللوكيميا الحادة
Summary
يتم التعبير عن مستقبلات التيروزين كيناز ectopically في العديد من أنواع السرطان وتم تحديدها كأهداف العلاجية في سرطان الدم الحاد. يصف هذا المخطوط استراتيجية فعالة لتقييم ما قبل السريرية من مثبطات كيناز التيروزين لعلاج سرطان الدم الحاد.
Abstract
قد تورطت مستقبلات التيروزين كيناز في تطور وتقدم العديد من أنواع السرطان، بما في ذلك سرطان الدم والأورام الصلبة، وتكون الأهداف العلاجية druggable جذابة. نحن هنا تصف استراتيجية من أربع خطوات فعالة لتقييم ما قبل السريرية مثبطات التيروزين كيناز (TKIs) في علاج سرطان الدم الحاد. في البداية، تم استخدام تحليل لطخة غربية لتأكيد تثبيط الهدف في خلايا سرطان الدم مثقف. ثم يتم تقييم النشاط الوظيفي باستخدام المقايسات مولد الرمع في ميثيل أو الثقافات أجار لينة. يتم تقييم المركبات التجريبية التي تثبت النشاط في المقايسات الثقافة خلية في الجسم الحي باستخدام NOD SCID جاما (مجموعة موردي المواد النووية) الفئران زرع orthotopically مع خطوط الخلايا البشرية سرطان الدم. الأولي في الدراسات المجراة الدوائية تقييم تثبيط الهدف في انفجارات معزولة عن اللوكيميا في نخاع العظام. ويستخدم هذا النهج لتحديد الجرعة والجدول الزمني اللازم لإدارة فعالة تمنع الهدفأيون. دراسات لاحقة تقييم فعالية TKIs في الجسم الحي باستخدام luciferase المراسل معربا عن خلايا سرطان الدم، مما يسمح للإضاءة الحيوية للرصد غير الغازية من عبء اللوكيميا وتقييم استجابة علاجية باستخدام في الجسم الحي تلألؤ بيولوجي نظام التصوير. وكانت هذه الاستراتيجية فعالة لتقييم TKIs في المختبر والمجراة ويمكن تطبيقها لتحديد وكلاء جزيئيا المستهدفة مع الإمكانات العلاجية أو للمقارنة المباشرة وإعطاء الأولوية للمركبات متعددة.
Introduction
سرطان الدم الليمفاوي الحاد (ALL) هو الورم الخبيث الأكثر شيوعا عند الأطفال 1،2. معدل البقاء على قيد الحياة عموما للأطفال ALL-B النسب (B-ALL) هو ما يقرب من 85٪، ولكن الأنواع الفرعية بيولوجية معينة، بما في ذلك النسب T-ALL (T-ALL)، يكون لا يزال الأكثر فقرا التكهن حتى مع البروتوكولات العلاجية الحالية. لا يزال مزيد من العلاج من انتكس ALL تحديا 3. على الرغم من أن الغالبية العظمى من المرضى البالغين المصابين بسرطان الدم الحاد تحقيق مغفرة مع العلاج الكيميائي في خط الهجوم، العديد من المرضى لا تزال تعاني من الانتكاس 4. ومن المعروف نظم العلاج الكيميائي الحالي في علاج سرطان الدم الحاد لتتسبب في آثار جانبية طويلة المدى القصير والمرتبطة سمية. وبالتالي، هناك حاجة ماسة إلى علاجات أقل سمية التي تستهدف على وجه التحديد خلايا السرطان مع تأثير ضئيل على الأنسجة الطبيعية. في السنوات الأخيرة، وقد تم التركيز على تطوير الرواية، وكلاء المستهدفة جزيئيا مع خصوصية لخلايا السرطان، وغالبا ما تستخدم الكيمياء التكراريةلتوليد المركبات النشطة المتعددة التي يجب عندئذ مقارنة وتحديد أولوياتها 5. يصف هذا المخطوط استراتيجية فعالة لتقييم ما قبل السريرية من TKIs لعلاج سرطان الدم الحاد، والتي يمكن استخدامها لتقييم مركب واحد أو لمقارنة مباشرة من المركبات متعددة من أجل تسهيل تطوير العقاقير.
طريقة المقدمة هنا يتكون من أربع خطوات. أولا البيوكيميائية (1) ومكافحة سرطان الدم (2) يتم تقييم أنشطة المجمع (ق) في خلية ثقافة، ثم يتم تأكيد تثبيط الهدف في النماذج الحيوانية (3)، وأخيرا الكفاءة العلاجية للTKI (ق) يتم تحديد سرطان الدم في نماذج طعم أجنبي مثلي (4). لهذه الدراسات، فمن المهم اختيار خطوط الخلايا ذات الصلة، والتي هي ممثلين عن الأنواع الفرعية البيولوجية الأكثر شيوعا. وينبغي اختيار خطوط الخلايا، والتي على حد سواء، والتعبير عن الهدف من الفائدة وتفتقر إلى الهدف من الفائدة، للتحقيق في ما إذا كانت الآثار البيولوجية ميدiated عن طريق تثبيط الهدف. وهذا هو ذات الصلة ولا سيما لتطوير مثبطات جزيء صغير، والتي لها آثار خارج الهدف التي قد تكون مهمة للنشاط المضادة للورم. من الضروري أيضا اختيار خط الخلية التي تعتمد على الهدف للآثار وظيفية مثل الانتشار أو البقاء على قيد الحياة. ويمكن استخدام دراسات التحقق من صحة الهدف الأولي (خارج نطاق هذه المقالة) باستخدام تدخل الحمض النووي الريبي أو وسائل أخرى محددة لمنع الهدف لتحديد خطوط الخلايا التي تعتمد على الهدف. ومن المستحسن أيضا لاختيار خطوط الخلايا التي يمكن أن تشكل xenografts الفئران، مثل أن نتائج زراعة الخلايا يمكن أن يكون ترجمة لفي التجارب المجراة على نحو أكثر مباشرة.
لتقييم النشاط البيوكيميائية بوساطة TKIs في خلايا سرطان الدم، انخفاض في مستقبلات الفسفرة يمكن استخدامها كمؤشر على تثبيط الهدف. ويمكن استخدام تحليل لطخة غربية أو ELISA المقايسات، وهذا يتوقف على مدى توافر ونوعية الأجسام المضادة.إذا كانت الأجسام المضادة مع خصوصية كافية لهدف المتاحة، فحوصات ELISA هي الأفضل لأنها أكثر كمية وكفاءة. في الحالات التي تكون فيها الأجسام المضادة مع خصوصية كافية لELISA ليست متاحة، قد يكون من الضروري تحليل لطخة غربية. في هذه الحالة، يمكن مناعي من كمية كبيرة من المحللة تكون مفيدة للكشف عن الأهداف التي هي في وفرة منخفضة. هذا النهج هو ذات الصلة ولا سيما لقياس الفوسفات، والبروتينات، والتي قد يكون لها نصف حياة قصيرة للسماح للتغيرات السريعة في إشارة استجابة للمؤثرات البيئية. بعض البروتينات فسفرته هي عطوب للغاية، وعلى الأرجح نتيجة لتشكيل معقدة مع phosphatases. للكشف قوية وثابتة من هذه البروتينات فسفرته، قد يكون من الممكن أيضا لعلاج الخلايا مع pervanadate، وهو لا رجعة فيه بروتين تيروزين الفوسفاتيز المانع 6، لتحقيق الاستقرار في الفوسفات من البروتين قبل إعداد لست] خلية كاملة.
إلىتحديد ما إذا كان النشاط البيوكيميائية النتائج في تأثيرات مضادة للورم، والعمليات البيولوجية التي تعتمد على الهدف يمكن رصدها في التجارب القائمة على الخلية. لخطوط خلية سرطان الدم، النشاط المضاد للسرطان الدم بوساطة TKIs يمكن تقييمها باستخدام فحوصات أجريت في تشكيل مستعمرة ميثيل أو أجار لينة 7. أجار لينة قد يكون من المفضل لأن هذا هو وسيلة الصلبة التي هي أكثر قابلية للتلاعب إذا كان العلاج تتكرر مع TKI ضروري. في حين أن العديد اللوكيميا myloid (AML) خطوط الخلايا الحادة وشكل مستعمرات في أجار لينة، فإن معظم خطوط الخلايا ALL تشكل فقط المستعمرات في ميثيل، والذي هو وسيلة شبه صلبة. على الرغم من أنه من الممكن لتحديث المتوسطة و / أو TKIs في الثقافات ميثيل، فقط كميات صغيرة يمكن استخدامها مع وتيرة محدودة. وبالمثل، فإنه من الصعب صمة عار المستعمرات دون تعطيل لهم في ميثيل. ينبغي أن تحدد الدراسات الأولية قدرة خطوط الخلايا المناسبة لشكل مستعمرات في ميثيل و / أو أجار لينة ورانه الكثافة المثلى من الخلايا في الثقافة بحيث المستعمرات غير قابلة للتداخل وعدد كاف إحصائيا للحصول على البيانات ذات الصلة (عادة 50-200 المستعمرات في لوحة 35 ملم).
بينما في فحوصات المختبر هي قوية وفعالة من حيث التكلفة، ولها آثار أخلاقية أقل من التجارب على الحيوانات كلها، والنهوض من المركبات العلاجية يتطلب دليلا على فعالية وسلامة في النماذج الحيوانية. لفي الدراسات المجراة، خطوط الخلايا البشرية سرطان الدم الحاد يمكن زرعها في orthotopically NOD.Cg-Prkdc SCID أنا l2rg tm1Wjl / SzJ (مجموعة موردي المواد النووية) الفئران وTKIs عن طريق الحقن أو عن طريق الفم بالتزقيم يمكن أن تدار بسهولة. بعض خطوط الخلايا قد تتطلب تعرض الفئران مجموعة موردي المواد النووية إلى خلية المنخفضة التي تعتمد على خط جرعة من الإشعاع من أجل xenografts أن ينشئ، والفئران في هذه الحالة قد لا تتسامح مع أنبوب تغذية عن طريق الفم دون فترة نقاهة 5-10 يوم آخر التشعيع. يصف هذا المخطوط جيل من B-ALL وT-ALL xenografts استخداميمكن إنشاء خطوط خلية معينة (697 وJurkat) كأمثلة ولكن xenografts في الفئران مجموعة موردي المواد النووية باستخدام مجموعة واسعة من خطوط الخلايا. في حال أن خطوط الخلايا الأخرى هي أكثر قابلية للتطبيق، شرط التشعيع، ينبغي تحديد العدد الأمثل من الخلايا لزرع، وتوقيت ظهور المرض وتطور تجريبيا. من الناحية المثالية، فإن هذه النماذج وانتفاذ كاملة (كل حيوان زرع يتطور سرطان الدم)، حركية متناسقة (اللوكيميا تقدم مماثل في جميع الحيوانات)، ونافذة معالجة معقولة (مثالي بين 20-30 يوما من بدء العلاج وإزالة من الدراسة بسبب المرض) . ويمكن زيادة عدد الخلايا المزروعة لتحسين انتفاذ والاتساق الحركية أو انخفضت إلى تحسين إطار العلاج إذا لزم الأمر.
لتحديد ما إذا TKIs تتدخل لإعاقة الهدف في الجسم الحي، يتم جمع عينات من الفئران مع xenografts سرطان الدم بعد العلاج مع TKI أو مركبة فقط. من الناحية المثالية، فإن جرعةوتسترشد جدول د الإدارة لهذه التجارب من خلال الدراسات الدوائية، والتي يمكن في كثير من الأحيان أن يقوم بها المختبرات التجارية وخارج نطاق هذا المقال. إذا كانت البيانات الدوائية المتاحة، وتركيز مركب المطلوبة لتثبيط فعالية المستهدفة في خلية ثقافة والحد الأقصى للتركيز مصل الدم بعد جرعة واحدة من TKI يمكن استخدامها لتحديد جرعة البداية لدراسات على الحيوانات. يمكن أن الدراسات الدوائية أيضا بإبلاغ توقيت جمع العينة بعد العلاج للدراسات الدوائية وطريقة التعاطي. تثبيط الهدف يمكن تقييمها في أي جهاز المتضررة ولكن الأنسجة التي يتم جمع معظم بسهولة ومعالجتها هي الأفضل. خطوط الخلايا سرطان الدم الحاد الأكثر إقامة في الكبد ونخاع العظم والطحال والدم المحيطي، والجهاز العصبي المركزي، على الرغم من أن أجهزة معينة المتضررة ومدى engraftment في هذه الأجهزة تختلف بين النماذج. بروتوكول المعروضة هنا يقيم phosphس البروتين تثبيط نخاع العظام في استخدام تحليل لطخة غربية، ولكن الأجهزة الصلبة قد يكون من الأسهل لجني باستمرار وتتطلب معالجة الحد الأدنى أو أي قبل التجميد، مما يتيح فرصة أقل للتدهور الفوسفات البروتينات أثناء جمع العينات وتجهيزها. ويمكن أيضا أن تستخدم المناعية لتقييم أورام أو الأجهزة المتضررة من سرطان الدم الصلبة.
أخيرا، يتم تحديد الكفاءة العلاجية للTKI (ق) في نماذج طعم أجنبي مثلي سرطان الدم. لهذه الدراسات، توقيت بدء العلاج يمكن أن تختلف، بحيث يتم إنشاء أكثر أو أقل المرض. العلاج قد تبدأ على الفور بعد زرع لإجراء الدراسات الأولية ومن ثم يتأخر في دراسات لاحقة حتى يتم الكشف عن عبء المرض كبيرة لتقريب أكثر عن كثب نموذج العلاج التشخيص. من الناحية المثالية، وهذه النماذج الحيوانية أيضا القدرة على القياس غير الغازية من عبء المرض. قمنا الأمثل للأساليب إدخال إبليس اليراعبورصة عمان الجين في خطوط الخلايا سرطان الدم باستخدام جزيئات الفيروسات مثل، والسماح لغير الغازية، وتحليل طولية من بداية ظهور أعراض المرض والتقدم وتقييم عبء المرض في نخاع العظام والأعضاء الصلبة. الحرجة لهذا النهج هو استخدام خطوط الخلايا وحيدة النسيلة الموسومة luciferase المراسل لمنع التقلبات في تطوير سرطان الدم، معربا عن luciferase المراسل المرتبطة باستخدام خطوط الخلايا بولكلونل والعلاج ليست لها علاقة مع TKI 8.
أخذت معا، وهذه الخطوات يمكن استخدامها لتقييم لTKI واحدة أو للمقارنة المباشرة وترتيب TKIs متعددة. بينما البروتوكولات المعروضة هنا التركيز على تطوير TKIs، وهذه الأساليب يمكن تكييفها لأهداف أخرى وموصوفة اعتبارات للتنمية الفحص. وبالتالي، قد يكون هذا أكثر قابلية للتطبيق على نطاق واسع الاستراتيجية لتقييم ما قبل السريرية وكلاء جزيئيا المستهدفة للعلاج من سرطان الدم الحاد.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا المخطوط استراتيجية فعالة لتقييم مثبطات التيروزين كيناز الرواية في علاج سرطان الدم الحاد. باستخدام هذا النهج، يتم تقييم الأنشطة البيوكيميائية ومكافحة سرطان الدم الأول في المقايسات خلية مقرها في المختبر ثم في نماذج طعم أجنبي في الجسم الحي. تم استخدا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
في الجسم الحي التصوير تم تنفيذها باستخدام IVIS الموارد المشتركة في جامعة كولورادو مركز السرطان (بدعم من منحة P30-CA046934). تم تنفيذ التدفق الخلوي في التدفق الخلوي الموارد المشتركة، مركز جامعة كولورادو للسرطان (بدعم من منحة P30CA046934). وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة (RO1CA137078 إلى DKG). ABLS هو زميل في برنامج التنمية للأطفال عالم، بدعم من المنح المقدمة من الأكاديمية الأميركية لطب الأطفال، وجمعية طب الأطفال الأمريكية، وكينيدي شرايفر المعهد الوطني يونيس لصحة الطفل والتنمية البشرية (K12-HD000850).
Materials
| Reagent/Material | |||
| Hydrogen Peroxide | MP Biomedicals | #02194057 | GHS05, GHS07, H302-H318 |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | #S6508 | GHS07, H302+ H312+H332 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | #M7522 | GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410 |
| ColonyGel Human Base Medium | ReachBio | #1101 | |
| 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) | Sigma | #M5655 | GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341 |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | #214883 | |
| Nitrotetrazolium Blue Chloride | Sigma | #N6639 | GHS07, H302 |
| D-Luciferin Firefly, Potassium Salt | PerkinElmer | #122796 | |
| 4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride | Sigma | #D9542 | |
| FITC CD45 | BD Bioscience | #347463 | |
| FITC Mouse IgG1 Isotype control | BD Bioscience | #51-35404X-2 | |
| Gentamycin Sulfate | Sparhawk | #NDC58005-633-04 | |
| Protease Inhibitors | Roche | #11836153001 | |
| DNase | Sigma | #D4263 | |
| Protein G Beads | Invitrogen | #10-1242 | |
| Isofluran | VETONE | #NDC13985-030-60 | |
| Equipment | |||
| Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm | Nunclon | #D7804-500EA | |
| Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm | Nunclon | #D8429-1CS | |
| 6-well plates | BD Bioscience | #353046 | |
| 14 gauge x 4 inch blunt-end needles | Cadence science | #7956 | |
| 5 ml syringe with luer-lok | BD Bioscience | #309646 | |
| GelCount automated colony counter | Oxford Optronix | ||
| In vivo bioluminescence imaging system | PerkinElmer | #IVIS200 | |
| Scout pro portable balances, scale | Ohaus | #SP202 | |
| Broome style rodent restrainer | Plas-labs | #551-BSRR | |
| Ear punch, punch diameter: 2 mm | FST | #24210-02 | |
| Chlorhexidine swabs, Prevantics | PDI | #B10800 | |
| Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2 | Monoject | #8881500042 | |
| Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile | Instech | #FTP-20-38 | |
| 1 mL Luer-Lok disposable syringe | BD Bioscience | #309628 | |
| Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle | BD Bioscience | #329465 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | #14084-08 | |
| Student fine scissors | FST | #91460-11 | |
| Moria ultra fine forceps | FST | #11370-40 | |
| Extra fine graefe forceps | FST | #11150-10 | |
| Scalpel handle | FST | #10003-12 | |
| Scalpel blades | FST | #10011-00 |
References
- Jemal, A., Siegel, R., Xu, J. Cancer Statistics. 2010. CA Cancer J. Clin. 60, 277-300 (2010).
- Kaatsch, P. Epidemiology of childhood cancer. Cancer Treat Rev. 36, 277-285 (2010).
- Pui, C., Mullighan, C., Evans, W., Relling, M. Pediatric acute lymphoblastic leukemia: where are we going and how do we get there?. Blood. 120, 1165-1174 (2012).
- Forman, S., Rowe, J. M. The myth of the second remission of acute leukemia in the adult. Blood. 121, 1077-1082 (2013).
- Ohanian, M., Cortes, J., Kantarjian, H., Jabbour, E. Tyrosine kinase inhibitors in acute and chronic leukemias. Expert Opin Pharmacother. 13, 927-938 (2012).
- Mikalsen, S., Kaalhus, O. Properties of pervanadate and permolybdate. Connexin43, phosphatase inhibition, and thiol reactivity as model systems. J. Biol. Chem. 273, 10036-10045 (1998).
- Zips, D., Thames, H., Baumann, M. New anticancer agents: in vitro and in vivo evaluation. In Vivo. 19, 1-7 (2005).
- Christoph, S., et al. Bioluminescence imaging of leukemia cell lines in vitro and in mouse xenografts: Effects of monoclonal and polyclonal cell populations on intensity and kinetics of photon emission. J. Hematol. Oncol. 6, 10 (2013).
- Endresen, L., Tveit, K., Rugstad, H., Pihl, A. Chemosensitivity measurements of human tumour cells by soft agar assays are influenced by the culture conditions. Br. J. Cancer. 51, 843-852 (1985).
- Tveit, K., Endresen, L., Rugstad, H., Fodstad, O., Pihl, A. Comparison of two soft-agar methods for assaying chemosensitivity of human tumours in vitro: malignant melanomas. Br. J. Cancer. 44, 539-544 (1981).
- Rudin, M., Weissleder, R. Molecular imaging in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 2, 123-131 (2003).
- Barrett, D., et al. Noninvasive bioluminescent imaging of primary patient acute lymphoblastic leukemia: a strategy for preclinical modeling. Blood. 118, 112-117 (2011).
- Rice, B., Cable, M., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. J. Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).
