Summary

Multiplexado fluorescente microarrays para el análisis de proteínas salivales humanas utilizando microesferas poliméricas y Paquetes de fibra óptica

Published: October 10, 2013
doi:

Summary

Se describe un procedimiento para crear perfiles de proteínas salivales usando multiplexados arrays de anticuerpos basados ​​en microesferas. Los anticuerpos monoclonales se unen covalentemente al colorante fluorescente codificada 4,5 micras microesferas de polímero utilizando química de la carbodiimida. Las microesferas modificadas fueron depositados en micropocillos de fibra óptica para medir los niveles de proteína en la saliva usando inmunoensayos de tipo sándwich de fluorescencia.

Abstract

En la presente memoria, se describe un protocolo para medir simultáneamente seis proteínas en la saliva utilizando una matriz de anticuerpos basados ​​en microesferas de fibra óptica. La tecnología de inmuno-matriz empleada combina las ventajas de la suspensión de microesferas a base de matriz de la fabricación con el uso de microscopía de fluorescencia. Como se describe en el protocolo de vídeo, comercialmente disponibles microesferas de polímero 4,5 micras fueron codificados en siete tipos diferentes, que se diferencian por la concentración de dos colorantes fluorescentes atrapados físicamente dentro de las microesferas. Las microesferas codificadas que contienen grupos carboxilo superficiales fueron modificados con anticuerpos de captura monoclonales través de la química de acoplamiento EDC / NHS. Para ensamblar el microarray de proteínas, los diferentes tipos de microesferas codificadas y funcionalizados se mezclaron y se depositan aleatoriamente en 4,5 micras micropocillos, que fueron grabadas químicamente en el extremo proximal de un haz de fibra óptica. El haz de fibra óptica se utiliza como un portador y para obtener imágenes de la microspheres. Una vez montado, se utilizó el microarray para capturar las proteínas en el sobrenadante de la saliva obtenida de la clínica. La detección se basa en un inmunoensayo de tipo sándwich usando una mezcla de anticuerpos de detección biotinilados para diferentes analitos con una sonda fluorescente conjugada con estreptavidina, R-ficoeritrina. La micromatriz Se obtuvieron imágenes por microscopía de fluorescencia en tres canales diferentes, dos para el registro de microesferas y uno para la señal de ensayo. Las micrografías de fluorescencia se descodifican y se analizaron usando un algoritmo de hecho en casa en MATLAB.

Introduction

Desde la primera micromatriz reportado por Mark Schena y compañeros de trabajo a mediados de la década de 1990, esta potente herramienta se ha utilizado en muchos campos de la investigación biológica 1. Microarrays de anticuerpos capaces de detectar simultáneamente múltiples proteínas en los fluidos de diagnóstico, tales como la sangre, tienen aplicaciones importantes en el diagnóstico clínico y la detección de biomarcadores 2-10. La saliva, que contiene muchos de los mismos analitos como la sangre, ha sido considerada como una alternativa preferible a la sangre debido a la toma de saliva es segura, no invasiva, y puede ser llevado a cabo por el personal médico mínimamente entrenados 11-13. Actualmente, el análisis de proteínas multiplexada usando muestras de saliva está limitado por varios factores importantes, incluyendo la baja concentración de analito diana 14 y el amplio intervalo de concentración de diferentes biomarcadores 15.

.

En este documento, se demuestra el análisis de seis proteínas: factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF), proteína inducida por gamma-interferón 10 (IP-10), interleucina-8 (IL-8), factor de crecimiento epidérmico (EGF), metalopeptidasa matriz 9 (MMP-9), y la interleucina-1 beta (IL-1β) . El rendimiento del método se verificó inicialmente usando soluciones estándar que constituyen las proteínas recombinantes de analito y tampón de bloqueo. Muestras de saliva real obtenida de pacientes de diferentes enfermedades respiratorias crónicas, así como también controles sanos se probaron con un rendimiento satisfactorio. El protocolo debe ser aplicable a otros analitos de proteínas y otros ensayos basados ​​en microesferas. Esta plataforma ofrece ventajas considerables para el campo de la Química Analítica, ya que permite el análisis simultáneo rápido, preciso, y reproducible de bajas concentraciones de varias proteínas con un amplio rango dinámico, un mínimo de interacciones no específicas, la reducción del consumo de la muestra, y de bajo costo en comparación con un Ensayo inmunoenzimático análoga (ELISA).

Protocol

Figura 1. . Flujo de trabajo para la aplicación de matriz de anticuerpos de microesferas de fibra óptica a la saliva de perfiles (1) Las microesferas se codifican internamente con dos colorantes fluorescentes; (2) las microesferas codificadas son modificados externamente con anticuerpos monoclonales específicos de proteínas; (3) las microesferas multipl…

Representative Results

Las imágenes de fluorescencia de tres canales que muestran una pequeña sección del haz de fibra óptica se muestran en las Figuras 2A-C. Estas imágenes se analizaron utilizando un algoritmo escrito en MATLAB (como se describe en más detalle en la sección Discusión). El análisis utiliza tanto la información de la imagen de codificación de Eu-TTA (Figura 2A) y la imagen de codificación de C30 (Figura 2B) para decodificar las microesferas, y se calcularon las in…

Discussion

Los investigadores deben prestar especial atención a los siguientes pasos: para una mayor precisión de decodificación, es necesario verificar que las microesferas fueron suspendidas de forma homogénea en toda la incubación y el lavado pasos durante el proceso de codificación de microesferas. Además, las microesferas codificadas necesitan ser protegidos de la luz a lo largo de todo el experimento. Siguiendo los procedimientos de codificación y de almacenamiento adecuadas, encontramos que la precisión global de d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (subvención 08UDE017788-05). EBP también reconoce el apoyo de la Fundación Española para la Ciencia y la Tecnología (FECYT). Los autores agradecen a Shonda T. Gaylord y Pratyusha Mogalisetti para la lectura crítica del manuscrito.

Materials

Name of Reagent Company Catalog Number Comments
Eu-TTA dye Fisher Scientific AC42319-0010
THF Sigma-Aldrich 34865-100ML
Amber glass vial Fisher Scientific 03-339-23B
Coumarin 30 dye Sigma-Aldrich 546127-100MG
Microspheres Bangslabs PC05N/6698
1.5 ml microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-129
PBS 10x concentrate Sigma-Aldrich P5493-1L
Water Sigma-Aldrich W4502-1L
Methanol Sigma-Aldrich 34860-100ML
Tw-20 Sigma-Aldrich P7949-100 ml
BupH MES buffered saline Thermo Scientific 28390
SDS Sigma-Aldrich 05030-500ML-F
NaOH solution Fisher Scientific SS256-500
Safe-lock microcentrifuge tube VWR labshop 53511-997
EDC Thermo Scientific 22980
Sulfo-NHS Thermo Scientific 24510
Human VEGF capture antibody R&D Systems MAB293
Human IP-10 capture antibody R&D Systems MAB266
Human IL-8 capture antibody R&D Systems MAB208
Human EGF capture antibody R&D Systems MAB636
Human MMP-9 capture antibody R&D Systems MAB936
Human IL-1β capture antibody R&D Systems MAB601
Mouse IgG1 isotype control antibody R&D Systems MAB002
StartingBlock (TBS) buffer Thermo Scientific 37542
HCl standard solution 1.0 N Sigma-Aldrich 318949-500 ml
0.5 ml microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-120
Protein-free (PBS) buffer Thermo Scientific 37572
Recombinant human VEGF 165 R&D Systems 293-VE
Recombinant human IP-10 R&D Systems 266-IP
Recombinant human IL-8 R&D Systems 208-IL
Recombinant human EGF R&D Systems 236-EG
Recombinant human MMP-9 R&D Systems 911-MP
Recombinant human IL-1β R&D Systems 201-LB
StartingBlock T20 (PBS) buffer Thermo Scientific 37539
Blocker BSA in PBS Thermo Scientific 37525
Biotinylated VEGF detection antibody R&D Systems BAF293
Biotinylated IP-10 detection antibody R&D Systems BAF266
Biotinylated IL-8 detection antibody R&D Systems BAF208
Biotinylated EGF detection antibody R&D Systems BAF236
Biotinylated MMP-9 detection antibody R&D Systems BAF911
Biotinylated IL-1β detection antibody R&D Systems BAF201
Streptavidin, R-phycoerythrin Invitrogen S-21388
Ethanol (200 proof) Sigma-Aldrich E7023-500ML

References

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Cite This Article
Nie, S., Benito-Peña, E., Zhang, H., Wu, Y., Walt, D. R. Multiplexed Fluorescent Microarray for Human Salivary Protein Analysis Using Polymer Microspheres and Fiber-optic Bundles. J. Vis. Exp. (80), e50726, doi:10.3791/50726 (2013).

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